生乳湯回流提取工藝優(yōu)化

李蘭蘭， 虎亞光， 賈新燁， 張 睿， 譚建偉

(甘肅省婦幼保健院藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730050)

母乳喂養(yǎng)對母嬰健康都有重要意義，我國《中國兒童發(fā)展綱要(2011—2020年)》和《國民營養(yǎng)計劃(2017—2030)》[1-2]都明確提出，到2020年0～6個月嬰兒純母乳喂養(yǎng)率達(dá)到50%以上目標(biāo)。但《中國母乳喂養(yǎng)影響因素調(diào)查報告(2019年)》顯示，我國6個月內(nèi)嬰兒純母乳喂養(yǎng)率僅為29.2%，遠(yuǎn)低于43%的世界平均水平[3]。

泌乳量不足是導(dǎo)致純母乳喂養(yǎng)失敗的主要原因之一[4]，發(fā)病率約為20%～30%[5-6]。中醫(yī)認(rèn)為，氣血郁閉和氣血虧虛是產(chǎn)后缺乳的主要病因病機(jī)[5,7]。生乳湯以傳統(tǒng)驗方為基礎(chǔ)，根據(jù)中醫(yī)對產(chǎn)后缺乳的主要分型、治療產(chǎn)后缺乳的基本用藥配伍規(guī)律組方，由當(dāng)歸、川芎、芍藥等藥材組成，在臨床應(yīng)用中呈現(xiàn)出較好的催乳效果。本實驗采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化生乳湯回流提取工藝，以期為該方進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；SQP型電子分析天平[十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；TWCL-T型調(diào)溫磁力攪拌器(海科靂儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 當(dāng)歸(甘肅和潤醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號201101A)；川芎(蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，批號20072101)；炒白芍(甘肅康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號200310)；柴胡(甘肅和潤醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號200903)，經(jīng)專家鑒定為正品。阿魏酸(批號D1804017，純度≥99.5%)、芍藥苷(批號D1728076，純度≥98%)對照品均購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。乙腈為色譜純(德國Merck公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿魏酸、芍藥苷含量測定

2.1.1 色譜條件 Accucore aQ C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流動相乙腈-0.05 mol/L磷酸(16∶84)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長232 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液 精密稱取阿魏酸、芍藥苷對照品適量，甲醇溶解，即得(兩者質(zhì)量濃度分別為136.67、640 μg/mL)。

2.1.2.2 供試品溶液 按照處方比例稱取藥材，加10倍量80%乙醇浸泡30 min，回流提取1 h，提取液冷卻至室溫，取200 μL，水浴揮干，加1 mL甲醇溶解殘渣，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液 按處方量稱取缺當(dāng)歸和川芎、缺炒白芍的藥材，制成陰性樣品，按“2.1.2.2”項下方法制備，即得。

2.1.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，該方法專屬性良好，陰性無干擾。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項下對照品溶液，稀釋成阿魏酸(芍藥苷)質(zhì)量濃度分別為91.11(426.67)、45.55(213.33)、22.78(106.67)、12.42(58.18)、4.14(19.39)、1.77(8.31)μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得阿魏酸、芍藥苷方程分別為Y=0.511X+0.478(R2=0.999 3)、Y=0.220 3X+1.824 1(R2=0.999 0)，分別在91.11～1.77、426.67～8.31 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得阿魏酸、芍藥苷峰面積RSD分別為0.36%、0.19%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一批提取液6份，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得阿魏酸、芍藥苷含量RSD分別為2.18%、3.78%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8 h在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得阿魏酸、芍藥苷峰面積RSD分別為0.36%、0.87%，表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取同一份各成分含量已知的提取液6份(阿魏酸10.791 μg/mL、芍藥苷169.83 μg/mL)，分別加入80%、100%、120%水平對照品溶液，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，阿魏酸、芍藥苷平均加樣回收率分別為97.34%、98.01%，RSD分別4.07%、2.58%。

2.2 浸膏得率測定 在恒重器皿中加入提取液40 mL，置于95 ℃烘箱中烘干，移至干燥器中冷卻至室溫，立即稱定質(zhì)量，計算浸膏得率，公式為得率=[(提取液中浸膏量×提取液總體積)/(處方藥材總量×40)]×100%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 料液比 按處方比例稱取藥材5份，80%乙醇分別按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14料液比回流提取60 min，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，料液比為1∶14時阿魏酸含量最高，故選擇1∶12～1∶20作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 按處方比例稱取藥材5份，分別用50%、60%、70%、80%、90%乙醇按1∶10料液比回流提取60 min，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時阿魏酸含量最高，故選擇50%～90%作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.3 提取時間 按處方比例稱取藥材5份，80%乙醇按1∶10料液比分別回流提取30、60、90、120、150 min，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，提取時間為60 min時阿魏酸含量最高，故選擇30～90 min作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.4 提取次數(shù) 按處方比例稱取藥材3份，80%乙醇按1∶10料液比分別回流提取1、2、3次，每次60 min，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，提取次數(shù)為2次時阿魏酸含量最高，故選擇2次，并不再進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 Box-behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)作為影響因素，固定提取次數(shù)為2次，阿魏酸(Y1)、芍藥苷(Y2)含量及浸膏得率(Y3)作為評價指標(biāo)，設(shè)計三因素三水平試驗，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

采用Design-Expert 11.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得方程分別為Y1=-27.292 44+0.904 35A+1.102 62B+0.390 425C-0.008 356A2-0.043 734B2-0.002 014C2(R2=0.948 9，信噪比19.260 9)、Y2=-1 036.293 1+22.049 06A+41.845 94B+4.949 29C-0.168 875AB-0.145 266A2-0.932 422B2-0.021 415C2(R2=0.962 5，信噪比18.309 7)、Y3=-27.254 06+0.942 125A+1.905 31B+0.349C-0.008 997A2-0.046 797B2-0.001 979C2(R2=0.960 6，信噪比20.914 4)，方差分析分別見表3～5，可知模型具有高度顯著性，數(shù)據(jù)無異常點。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 阿魏酸含量方差分析

表4 芍藥苷含量方差分析

表5 浸膏得率方差分析

響應(yīng)面分析見圖2，可知固定提取時間時，阿魏酸含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比增加逐漸降低，芍藥苷含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比增加先升后降，浸膏得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比增加逐漸降低。

2.5 驗證試驗 最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)57.79%，料液比1∶14.248，提取次數(shù)2次，每次90 min，阿魏酸、芍藥苷含量及浸膏得率分別為22.725 mg、292.64 mg、30.17%，考慮到實際操作可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)58%，料液比1∶14，提取次數(shù)2次，每次90 min。按照上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗證試驗，測得阿魏酸、芍藥苷含量及浸膏得率分別為22.31 mg、291.69 mg、30.54%，RSD分別為1.89%，1.25%、1.13%，與預(yù)測值22.725 mg、292.64 mg、30.17%接近(偏差分別為1.31%、0.22%、0.86%)，表明該模型合理，工藝穩(wěn)定。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 阿魏酸在217、235、322 nm波長處有紫外吸收峰[8]，其中322 nm處吸收最強(qiáng)，而芍藥苷在192、232 nm波長處有紫外吸收峰[9]，為了保證能同時測定2種成分含量，故選擇232 nm作為檢測波長。再考察流動相甲醇-水、乙腈-水的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者洗脫時分離度較好，但色譜峰有拖尾現(xiàn)象，由于阿魏酸是有機(jī)酸，易電離[10]，故加入磷酸以改善峰形，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(16∶84)分離情況理想。

3.2 評價指標(biāo)確定 當(dāng)歸、川芎中均含有阿魏酸，是從當(dāng)歸中最早分離出的有機(jī)酸[11-13]，也是2015年版《中國藥典》[14]2種藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分；白芍具有養(yǎng)血、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用，單萜糖苷類化合物白芍總苷是該藥材主要活性物質(zhì)，其中芍藥苷含量最高，約達(dá)3%[15-16]，故本實驗選擇阿魏酸、芍藥苷作為指標(biāo)。另外，浸膏得率是評價提取工藝的重要指標(biāo)之一，與后期制劑的生產(chǎn)成本和療效密切相關(guān)，故本實驗也選擇其作為指標(biāo)。

4 結(jié)論

本實驗采用Box-behnken響應(yīng)面法優(yōu)化生乳湯回流提取工藝，該方法穩(wěn)定可靠，可用于該方后續(xù)劑型的研究。