珠子參總皂苷的HPLC特征圖譜及化學(xué)成分研究

任華忠， 朱麗金， 何毓敏*

(1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂山 614000；2.三峽大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研三級實驗室，湖北 宜昌 443002)

珠子參系五加科人參屬植物珠子參Panaxjaponicusvar.major。其性苦、甘，微寒，歸肝、肺、胃經(jīng)，補(bǔ)肺養(yǎng)陰，祛瘀止痛，止血，常用于氣陰兩虛，煩熱口渴，虛勞咳嗽[1]。珠子參具有具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)具有廣泛的作用[2-6]。

珠子參所含皂苷類成分是其重要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[7-11]，珠子參不同規(guī)格等級藥材含總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過10%[12]，以竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷Ⅳ以及竹節(jié)參皂苷V等齊墩果烷型皂苷為主，尚含少量人參皂苷Re、人參皂苷Rg1等達(dá)瑪烷型皂苷。

珠子參總皂苷的制備工藝，主要步驟包括水提或醇提后，以大孔吸附樹脂柱層析和或溶劑萃取進(jìn)行富集純化[13-14]。在前期研究中，建立了一種穩(wěn)定簡便的珠子參總皂苷的制備工藝，可保證提取物產(chǎn)品的總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于80%，轉(zhuǎn)移率超過85%[15]。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了珠子參總皂苷的HPLC特征圖譜[16-21]，鑒定成分，為珠子參總皂苷的質(zhì)量控制與藥效學(xué)研究提供參考。

1 材料

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國DIONEX公司)；LC3000型半制備高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；Bruker AV 400 核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；U-5500型紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；LD4-40型低速大容量離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；FD-1C-80型冷凍干燥儀(北京博醫(yī)康實驗有限公司)；AB204-N型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

柱層析用正相色譜硅膠，購于煙臺化學(xué)工業(yè)研究所；反相色譜硅膠Cosmosil 75 C18OPN，購于日本NacalaiTesque公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠，購于美國GE公司；X-5大孔吸附樹脂，購于天津南開和成科技有限公司；硅膠GF254薄層層析預(yù)制板，購于煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司。人參皂苷Re(PCS0770)、人參皂苷Rg1(PCS0762)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa(PCS1015)、竹節(jié)參皂苷Ⅳ(PCS1095)和竹節(jié)參皂苷V(PCS0778)，均購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。

珠子參原植物采自云南省維西縣、玉龍縣以及湖北省神農(nóng)架林區(qū)，共6批，經(jīng)三峽大學(xué)何毓敏博士鑒定為珠子參Panaxjaponicusvar.major，見表1。珠子參根莖洗凈后，除去粗皮和須根，切片(厚約2～5 mm)并曬干。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備 珠子參飲片粉碎，過二號篩，稱取適量，用8倍量的水煎煮3次，每次40 min，分離提取液和藥渣。提取液合并后，適當(dāng)濃縮，制成每1 mL含0.2 g生藥量的供試品溶液，備用。

2.2 竹節(jié)參皂苷Ⅳa及總皂苷含量測定 按照2020年版《中國藥典》項下方法和文獻(xiàn)[15]操作，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果

2.3 珠子參總皂苷提取物的制備及含量測定 采用X-5型大孔吸附樹脂對珠子參水提液進(jìn)行純化，上樣量為每克樹脂10 g生藥，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為每克樹脂5 mL。6批珠子參總皂苷提取物(S1～S6)，測定其總皂苷的含量，計算總皂苷轉(zhuǎn)移率，見表2。

2.4 HPLC特征圖譜的建立

2.4.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷Ⅳ以及竹節(jié)參皂苷V對照品適量，分別加入甲醇溶解并適當(dāng)稀釋后，搖勻，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 取珠子參總皂苷樣品約0.2 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 Ultimate LP-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～19%A；15～25 min，19%～23%A；25～40 min，23%～32%A；40～60 min，32%～70%A；60～65 min，70%～70%A)；檢測波長205 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。色譜圖見圖1。其中，竹節(jié)參皂苷Ⅳa色譜峰(峰11)分離度較好，峰面積適中，且保留時間合適，因此將其作為珠子參總皂苷提取物HPLC特征圖譜的參照峰(S)。

2.4.4 精密度試驗 取同一份珠子參總皂苷(S5)供試品溶液，在“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖。以11號峰為參照峰，各個特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份珠子參總皂苷(S5)供試品溶液，分別于0、6、12、18、24、48 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以11號峰為參照峰，各個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗 取珠子參總皂苷(S5)樣品適量，共6份，精密稱定后，在“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.4.3”項下色譜條件測定。以11號峰為參照峰，各特征峰相對保留時間的RSD均小于2%，相對峰面積RSD均小于4%，表明方法重復(fù)性較好。

2.4.7 特征圖譜的建立與相似度分析 取6批次自制的珠子參總皂苷，在“2.4.3”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行分析，選擇S5供試品色譜圖為參考圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)定為0.2 min，經(jīng)多點校正自動匹配，生成生成珠子參總皂苷樣品的疊加圖譜和對照圖譜(R)，見圖1。在S1～S6中確認(rèn)了16個共有峰，非共有峰面積占總峰面積分別為1.57%、7.33%、4.72%、7.35%、3.32%和5.92%。通過與各對照品的保留時間進(jìn)行對比，指認(rèn)了5個共有峰，分別是4號峰(tR=33.9 min)為人參皂苷Re，5號峰(tR=34.0 min)為人參皂苷Rg1，8號峰(tR=48.2 min)為竹節(jié)參皂苷V，10號峰(tR=49.5 min)為竹節(jié)參皂苷Ⅳ，11號峰(tR=50.3 min)為竹節(jié)參皂苷Ⅳa。

以竹節(jié)參皂苷Ⅳa色譜峰(峰11)為參照峰，計算各批次樣品色譜圖中共有峰的相對保留時間和相對峰面積及RSD，見表3。各批次樣品色譜圖與對照特征圖譜的相似度，分別為0.963、0.979、0.972、0.969、0.972、0.887。除S6外，各批次樣品化學(xué)組成的均一性較好。各批次樣品的峰容量基本相似，但是峰面積存在明顯差異。

表3 共有峰的相對保留時間和相對峰面積

2.5 化學(xué)成分鑒定

2.5.1 提取與分離 取珠子參藥材1.6 kg，粉碎，加入8倍量的雙蒸水，加熱回流提取3次，每次1.5 h，合并，濃縮。濃縮液依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別得到乙酸乙酯部位和正丁醇部位。HPLC分析發(fā)現(xiàn)，在乙酸乙酯部位色譜圖中可見共有峰6～16；而在正丁醇部位色譜圖中，竹節(jié)參皂苷V(峰8)、竹節(jié)參皂苷Ⅳ(峰10)和竹節(jié)參皂苷Ⅳa(峰11)的色譜峰清晰明顯，而其他共有峰因與上述三個特征峰的峰高差異巨大，僅可見共有峰4、5和12。為此，選擇乙酸乙酯部位進(jìn)行共有特征峰對應(yīng)目標(biāo)成分的定向分離。

乙酸乙酯部位(12 g)經(jīng)柱層層析硅膠，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫(9∶1～3∶1)，收集各流分后減壓濃縮，得到7個流分Fr.1～Fr.7。Fr.2經(jīng)硅膠柱色譜(環(huán)己烷-乙酸乙酯)洗脫后，以半制備高效液相進(jìn)行純化，得化合物1(8.6 mg)。Fr.3經(jīng)Cosmosil 75C18-OPN反相硅膠柱色譜(甲醇-水)洗脫后，以半制備高效液相進(jìn)行純化，得化合物2(21.3 mg)。Fr.4經(jīng)硅膠柱色譜(環(huán)己烷-丙酮)反復(fù)洗脫后，以半制備高效液相進(jìn)行純化，得化合物3(5.1 mg)。Fr.6以制備型薄層層板硅膠板(二氯甲烷-甲醇，5∶1)展開分離后，刮下目的條帶，碾成粉末后干法裝柱并洗脫，收集流分以半制備高效液相進(jìn)行純化，得到化合物4(11.4 mg)、5(6.2 mg)。

2.5.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：白色粉末，13C-NMR(400 MHz，Pyridine-d5)δ：39.7(C-1)，28.4(C-2)，78.4(C-3)，39.3(C-4)，56.2(C-5)，19.2(C-6)，33.5(C-7)，40.3(C-8)，48.5(C-9)，37.7(C-10)，24.2(C-11)，123.2(C-12)，144.5(C-13)，42.5(C-14)，28.6(C-15)，23.8(C-16)，47.3(C-17)，42.1(C-18)，46.6(C-19)，31.1(C-20)，34.3(C-21)，32.9(C-22)，29.1(C-23)，16.9(C-24)，16.0(C-25)，17.9(C-26)26.4(C-27)，176.8(C-28)，33.5(C-29)，24.0(C-30)，96.1(C-1′)，74.4(C-2′)，79.6(C-3′)，71.4(C-4′)，79.2(C-5′)，62.5(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]一致，鑒定為竹節(jié)參皂苷-1。

化合物2：白色粉末，13C-NMR(400 MHz，Pyridine-d5)δ：40.1(C-1)，28.4(C-2)，79.2(C-3)，40.9(C-4)，62.0(C-5)，80.6(C-6)，45.9(C-7)，41.8(C-8)，51.2(C-9)，40.3(C-10)，33.3(C-11)，73.0(C-12)，52.6(C-13)，51.7(C-14)，33.1(C-15)，31.3(C-16)，48.8(C-17)，18.4(C-18)，18.3(C-19)，155.9(C-20)，108.7(C-21)，34.3(C-22)，27.6(C-23)，125.9(C-24)，131.8(C-25)，26.4(C-26)，17.9(C-27)，32.3(C-28)，17.3(C-29)，16.9(C-30)，106.5(C-1′)，76.0(C-2′)，80.1(C-3′)，72.3(C-4′)，78.6(C-5′)，63.6(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]一致，鑒定為人參皂苷Rk3。

化合物3：白色粉末，13C-NMR(400 MHz，Pyridine-d5)δ：38.6(C-1)，26.5(C-2)，89.2(C-3)，39.5(C-4)，55.8(C-5)，18.5(C-6)，33.2(C-7)，39.8(C-8)，48.0(C-9)，37.0(C-10)，23.8(C-11)，122.5(C-12)，144.9(C-13)，42.2(C-14)，28.4(C-15)，23.8(C-16)，46.7(C-17)，42.0(C-18)，46.5(C-19)，31.0(C-20)，34.3(C-21)，33.2(C-22)，28.2(C-23)，17.0(C-24)，15.5(C-25)，17.4(C-26)，26.2(C-27)，180.2(C-28)，33.3(C-29)，23.8(C-30)，106.9(C-1′)，75.4(C-2′)，76.3(C-3′)，78.7(C-4′)，77.1(C-5′)，64.8(C-6′)，108.4(C-1″)，82.6(C-2″)，77.2(C-3″)，87.4(C-4″)，62.8(C-5″)。結(jié)合文獻(xiàn)，鑒定為齊墩果酸-3-O-[α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷[24-25]。

化合物4：白色粉末，13C-NMR(400 MHz，Pyridine-d5)δ：39.2(C-1)，26.7(C-2)，89.0(C-3)，40.0(C-4)，56.4(C-5)，18.4(C-6)，35.1(C-7)，39.7(C-8)，50.2(C-9)，36.9(C-10)，30.8(C-11)，70.2(C-12)，49.5(C-13)，51.6(C-14)，30.7(C-15)，26.6(C-16)，51.4(C-17)，16.2(C-18)，16.0(C-19)，83.4(C-20)，22.4(C-21)，36.2(C-22)，23.2(C-23)，125.9(C-24)，131.0(C-25)，25.8(C-26)，17.9(C-27)，28.1(C-28)，16.6(C-29)，17.4(C-30)，105.0(C-1′)，83.5(C-2′)，77.9(C-3′)，71.7(C-4′)，78.0(C-5′)，62.8(C-6′)，106.0(C-1″)，77.1(C-2″)，78.2(C-3″)，71.7(C-4″)，78.3(C-5″)，62.7(C-6″)，98.0(C-1?)，74.8(C-2?)，78.3(C-3?)，71.6(C-4?)，77.0(C-5?)，70.2(C-6?)，105.3(C-1″″)，75.2(C-2″″)，78.3(C-3″″)，71.6(C-4″″)，79.2(C-5″″)，62.9(C-6″″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]一致，鑒定為人參皂苷Rb1。

化合物5：白色粉末，13C-NMR(400 MHz，Pyridine-d5)δ：39.5(C-1)，26.8(C-2)，89.1(C-3)，39.6(C-4)，56.5(C-5)，18.5(C-6)，35.2(C-7)，40.1(C-8)，50.3(C-9)，37.0(C-10)，30.9(C-11)，70.3(C-12)，49.5(C-13)，51.5(C-14)，30.9(C-15)，26.8(C-16)，51.8(C-17)，16.5(C-18)，16.1(C-19)，83.4(C-20)，22.5(C-21)，36.3(C-22)，23.3(C-23)，126.1(C-24)，131.1(C-25)，25.9(C-26)，17.9(C-27)，28.2(C-28)，16.6(C-29)，17.5(C-30)，105.2(C-1′)，83.5(C-2′)，77.4(C-3′)，72.0(C-4′)，78.3(C-5′)，62.9(C-6′)，106.2(C-1″)，77.2(C-2″)，79.1(C-3″)，72.0(C-4″)，78.3(C-5″)，62.9(C-6″)，98.2(C-1?)，75.1(C-2?)，78.3(C-3?)，71.8(C-4?)，77.4(C-5?)，68.6(C-6?)，110.2(C-1″″)，83.6(C-2″″)，79.1(C-3″″)，86.2(C-4″″)，62.9(C-5″″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]一致，鑒定為人參皂苷Rc。

3 討論

在珠子參總皂苷進(jìn)行特征圖譜的研究中，考察乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸氫二鉀等，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸作為流動相時，各特征峰干擾小、分離度和精密度好，對色譜峰的分離效果較好，建立了珠子參總皂苷提取物的HPLC特征圖譜。從珠子參總皂苷提取物中分離并鑒定5個成分，分別為竹節(jié)參皂苷-1(16號峰)、人參皂苷Rk3(12號峰)、齊墩果酸-3-O-[α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(14號峰)、人參皂苷Rb1(6號峰)和人參皂苷Rc(7號峰)。