川烏中1個(gè)新的烏頭堿類二萜生物堿

馬 莉， 李新亮， 史丹丹， 冷雪嬌， 李存玉,2， 鄭云楓,2， 彭國(guó)平,2*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

川烏始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛莨科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根，其味辛、苦，性熱，有大毒，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效[1]，其化學(xué)成分主要為烏頭堿類二萜生物堿，也是主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)代藥理研究表明，烏頭堿型生物堿酯鍵的數(shù)量決定化合物毒性強(qiáng)弱，雙酯型毒性最強(qiáng)，在生川烏中含量最高[2-6]，主要分布在循環(huán)系統(tǒng)，具有很強(qiáng)的抗炎、消腫及鎮(zhèn)痛作用，但易導(dǎo)致各種心律失常的心臟毒性，從而限制了對(duì)單酯型及醇胺型烏頭堿類二萜生物堿的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。為了降低川烏中烏頭堿類雙酯型生物堿的毒性，探索相關(guān)藥物應(yīng)用的可能性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿水解讓酯鍵水解，分離得到3種烏頭堿類二萜生物堿，其中1個(gè)為新化合物。

1 材料

MicroTOF-Q質(zhì)譜儀、ASR-500核磁共振儀，購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；Waters e2695高效液相色譜儀，購(gòu)自美國(guó)Waters公司；Thermo Nicolet IR100紅外光譜儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；制備色譜柱Hedera ODS-2 C18(10 mm×250 mm，5 μm)；ELSD 6000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，購(gòu)自美國(guó)Auter公司；R-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)自瑞士Buchi公司；MS-105DU電子天平，購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多公司；LGJ18-D真空冷凍干燥機(jī)，購(gòu)自上海舜制儀器制造有限公司。

氘代吡啶，購(gòu)自上海凜恩科技發(fā)展有限公司；尼奧靈(批號(hào)JBZ-0866，純度大于98.0%)，購(gòu)自南京金益柏生物技術(shù)有限公司；AB-8大孔樹(shù)脂，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸、乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

川烏購(gòu)自亳州，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝教授鑒定為為毛莨科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根。

2 提取與分離

取鮮川烏切片15 kg，加氫氧化鈣250 g，置于煎煮鍋中加熱煎煮2次，第1次加水40 L，加熱煎煮1 h，濾出藥液；第2次加水35 L，加熱煎煮30 min，濾出藥液，合并2次濾液，靜置6 h，冷卻至50 ℃，上清液過(guò)濾。取2.5 L已預(yù)處理AB-8大孔樹(shù)脂，裝到層析柱中，水洗去除氣泡，加入藥液，待其流盡后用去離子水25 L洗脫去除無(wú)機(jī)物，依次用15%乙醇、0.1%甲酸、含0.1%甲酸的15%乙醇各10 L洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得總烏頭原堿，用80%乙醇溶解，經(jīng)制備液相[色譜條件為流動(dòng)相乙腈(A)-0.2%三氟乙酸(B)，梯度洗脫(0～50 min，11% ～21%A)；體積流量5.0 mL/min；柱溫30 ℃。ELSD檢測(cè)器氣體體積流量2.8 L/min；漂移管溫度110 ℃]，收集液回收溶劑至少量，冷凍干燥，得化合物1(75 mg)、2(20 mg)、3(15 mg)(保留時(shí)間分別為23.6、17.8、30.8 min)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀試劑顯色呈陽(yáng)性；[α]20D=4°(c=0.1，MeOH)，紫外光譜(MeOH)下沒(méi)有吸收，提示不具有α, β-不飽和系統(tǒng)。IR光譜顯示羥基(3 527 cm-1)的特征吸收。高分辨質(zhì)譜檢測(cè)可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z:438.282 9 [M+H]+(計(jì)算值為438.285 5)，確定分子式為C24H39NO6，不飽和度為6。此外，在質(zhì)譜圖中還可觀察到m/z:420.272 5[M+H-H2O]+、388.246 6[M+H-CH3OH-H2O]+、356.221 0[M+H-2CH3OH-H2O]+等碎片離子峰，符合烏頭堿質(zhì)譜裂解規(guī)律[7-11]。

在1H-NMR譜中，δH4.17 (1H, s)、4.45 (1H, d)分別給出2個(gè)可能為連氧碳上的質(zhì)子信號(hào)，δH3.27 (3H, s)、 3.30 (3H, s)、3.46 (3H, s)分別給出3個(gè)單峰甲基信號(hào)，δH1.30 (3H，t，J=14.3 Hz)為氮乙基中甲基(N-CH2-CH3)質(zhì)子信號(hào)；在13C-NMR譜中，給出24個(gè)碳信號(hào)，其中δC58.8、55.7、57.9處分別給出可能為3個(gè)連氧的甲基信號(hào)，δC70.8、74.1、75.2處分別給出3個(gè)連羥基信號(hào)，具體見(jiàn)表1。由HMBC譜可知，H-1(δ4.17)與C-3(δ28.2)、C-10(δ44.1)相關(guān)，H-5(δ2.26)與C-18(δ79.0)、C-17(δ64.2)、C-19(δ57.8)、C-7(δ53.8)、C-10(δ44.1)、C-4(δ38.2)、C-11(δ50.3)相關(guān)，H-6(δ4.47)與C-4(δ38.2)、C-8(δ74.1)、C-17(δ64.2)相關(guān)，H-7(δ2.48)與C-6(δ82.4)、C-8(δ74.1)、C-9(δ48.0)、C-11(δ50.3)、C-15(δ41.9)、C-17(δ64.2)相關(guān)，H-9(δ2.38)與C-8(δ74.1)、C-13(δ41.1)相關(guān)，H-15(δ2.86, 2.50)與C-7(δ53.8)、C-13(δ41.1)、C-16(δ82.7)相關(guān)，H-16(δ3.54)與C-14(δ75.2)、C-23(δ55.7)、C-12(δ30.8)相關(guān)，H-17(δ3.55)與C-6(δ82.4)、C-8(δ74.1)、C-19(δ57.8)、C-11(δ50.3)、C-5(δ43.4)相關(guān)，H-18(δ3.48, 3.52)與C-3(δ28.2)、C-4(δ38.2)、C-5(δ43.4)、C-19(δ57.8)相關(guān)，H-19(δ3.37, 3.24)與C-3(δ28.2)、C-5(δ43.4)、C-7(δ53.8)、C-8(δ74.1)相關(guān)，18-OCH3(δ3.27)與C-18(δ79.0)相關(guān)，16-OCH3(δ3.30)與C-16(δ82.7)相關(guān)，6-OCH3(δ3.46)與C-6(δ82.4)相關(guān)，δH1.30(3H)與氮上亞甲基碳(N-CH2-CH3)相關(guān)，平面結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，再以HMBC、H-H COSY譜進(jìn)行驗(yàn)證，見(jiàn)圖2。

表1 化合物11H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)

查閱文獻(xiàn)[12-15]可知，愛(ài)可寧平面結(jié)構(gòu)與尼奧寧相同，兩者1H-NMR(C5D5N，500 MHz)、13C-NMR(C5D5N，125 MHz)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，可知存在明顯差異，故推測(cè)化合物1可能為尼奧寧的手性異構(gòu)體，與后者結(jié)構(gòu)區(qū)別為1-位羥基的手性差異。

表2 愛(ài)可寧、尼奧寧1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)

從分子模型分析，由于1-位羥基處于低能態(tài)的平伏鍵(e)鍵，此時(shí)1位氫處于直立鍵，成單峰，A環(huán)發(fā)生從船式構(gòu)型轉(zhuǎn)變成椅式構(gòu)型的改變，從而使A環(huán)以及與A環(huán)連接碳上的質(zhì)子位移發(fā)生變化，此時(shí)1位氫處于直立鍵，仍然成單峰，見(jiàn)圖3。

由此可知，A環(huán)質(zhì)子H-1、H-2、H-3，A環(huán)鄰碳上質(zhì)子H-6、H-10、H-17、H-18、H-19，以及空間阻礙的相關(guān)質(zhì)子H-20、H-21均明顯發(fā)生位移，特別是H-1明顯向低場(chǎng)移動(dòng)(δH4.17～4.45)，H-17明顯向高場(chǎng)移動(dòng)(δH3.55～2.93)；H-18中2個(gè)氫化學(xué)位移相近，使dd峰重疊成δH3.50位置的t峰，而立體異構(gòu)化后差異變大，其中1個(gè)氫明顯向低場(chǎng)移動(dòng)至δH3.69，另1個(gè)為δH3.42，各呈d峰；H-19中2個(gè)氫有1個(gè)從δH3.37移至δH2.84，另1個(gè)從δH3.24移至δH2.39，即均明顯向高場(chǎng)移動(dòng)，兩者之間差值增大；N乙基上的質(zhì)子非常明顯，亞甲基向低場(chǎng)移動(dòng)，而甲基從δH1.30移動(dòng)至δH1.01，即明顯向高場(chǎng)移動(dòng)。因此，H-1、H-17、H-18中2個(gè)氫、H-19中2個(gè)氫、N乙基上的甲基質(zhì)子(H-21)可作為A環(huán)立體異構(gòu)體鑒定的特征，見(jiàn)表3。

表3 1-羥基立體異構(gòu)的氫譜特征

化合物1為烏頭堿結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化而來(lái)，從1-甲氧基的水解反應(yīng)機(jī)理來(lái)分析，其1-位手性在 -OH進(jìn)攻時(shí)從手性另一側(cè)進(jìn)攻，會(huì)發(fā)生手性反轉(zhuǎn)的變化。另外，NOESY譜可進(jìn)一步確證立體構(gòu)型，其中H-1和H-12、H-6和H-9/H-18、H-16和H-13/H-7、H-17和H-12/H-3、H-18和H-5/H-21、N-CH2-CH3和H-18/18-OCH3之間有NOE效應(yīng)。

采用多頻率位移激發(fā)雙梯度自旋回波1D NOESY對(duì)尼奧靈和化合物1的構(gòu)型差別進(jìn)行辨認(rèn)[16-18]，發(fā)現(xiàn)兩者H-17與H-1的空間取向不同，故通過(guò)選擇激發(fā)H-17來(lái)觀測(cè)H-1的NOE實(shí)驗(yàn)很容易鑒別這2種差向異構(gòu)體?；衔?的H-1與H-17是同向，有NOE效應(yīng)，而尼奧靈兩者是反向，無(wú)NOE效應(yīng)，故前者是后者1-位羥基的手性異構(gòu)體，將其命名為愛(ài)可寧，為首個(gè)鑒定出的烏頭堿類1-α-OH化合物，見(jiàn)圖4。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z:358[M+H]+，分子式C22H31NO3。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：5.51、5.48(brs，1H，H-17)，4.68(s，1H，H-15)，1.21(t,J=14.3 Hz，3H，-NCH2CH3)，0.68(s，3H，18-CH3)；13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：69.3(C-1)，31.7(C-2)，37.5(C-3)，34.8(C-4)，48.9(C-5)，22.8(C-6)，44.1(C-7)，49.1(C-8)，37.0(C-9)，52.9(C-10)，38.7(C-11)，209.0(C-12)，54.5(C-13)，31.1(C-14)，76.7(C-15)，151.7(C-16)，110.9(C-17)，25.5(C-18)，57.0(C-19)，65.4(C-20)，52.5(C-21)，11.7(C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，故鑒定為宋果靈。

化合物3：白色粉末，ESI-MSm/z:422[M+H]+，分子式C24H39NO5。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：3.27，3.26，3.20(s，3H，-OCH3×3)，1.28(t，J=12.5 Hz，3H，-NCH2CH3)；13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：83.0(C-1)，25.2(C-2)，29.7(C-3)，38.1(C-4)，34.5(C-5)，22.6(C-6)，41.4(C-7)，73.8(C-8)，47.0(C-9)，46.4(C-10)，49.3(C-11)，28.2(C-12)，45.1(C-13)，75.1(C-14)，40.6(C-15)，82.7(C-16)，62.5(C-17)，78.4(C-18)，51.4(C-19)，49.4(C-20)，11.5(C-21)，55.4(C-22)，55.8(C-23)，58.9(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致，故鑒定為塔拉烏頭胺。