金花茶葉提取物減輕動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

農(nóng) 微， 韋金銳， 陳柏承， 衛(wèi)智權(quán)

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200)

心腦血管疾病已連續(xù)多年位居我國(guó)人民死亡原因的首位，而且其發(fā)病率仍不斷增長(zhǎng)，其中動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病最主要的危險(xiǎn)因素[1]，早期缺乏特異癥狀，當(dāng)發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)已出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的粥樣硬化斑塊，故預(yù)防的意義大于后期的治療。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化與低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)及其氧化修飾形成的氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，ox-LDL)密切相關(guān)[2]，ox-LDL可使血管內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)細(xì)胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管粘附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)、P-選擇素(P-selectin)與巨噬細(xì)胞趨化蛋白1(macrophage chemotactic protein 1, MCP-1)，提升血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化血液循環(huán)中的單核細(xì)胞的能力，單核細(xì)胞逐漸衍變?yōu)榕菽?xì)胞進(jìn)而形成早期動(dòng)脈粥樣硬化病變的脂質(zhì)條紋，此后相繼出現(xiàn)粥樣和纖維粥樣斑塊及復(fù)合病變[3]。由上述病理過程可知，血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化單核細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程起始的關(guān)鍵，設(shè)法減少ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin，或能在早期遏止動(dòng)脈粥樣硬化病理進(jìn)程。

他汀類藥物已被證明對(duì)于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生是有效的，但長(zhǎng)期治療仍缺乏足夠的安全性保證，故尋找安全性更高的新型藥物非常重要[4]。金花茶葉為山茶科植物金花茶Camelliachrysantha(Hu) Tuyama的葉片，主要分布于中國(guó)廣西境內(nèi)，性平，味微苦、澀，是廣西壯族的傳統(tǒng)用藥，具有良好的清熱解毒作用[5]，本實(shí)驗(yàn)以其提取物為對(duì)象，采用體外含藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)來(lái)考察其基于負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin表達(dá)，從而抑制ox-LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化、粘附，以減輕動(dòng)脈粥樣硬化的潛在作用，以期為該藥材開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)、THP-1人單核細(xì)胞株，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0010；6周齡SPF級(jí)C57BL/6JGpt雄性小鼠8只、6周齡ApoE-/-雄性小鼠24只，均購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2018-0008，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度70%～80%。

1.2 藥材與藥物 金花茶葉購(gòu)自廣西峰下花貿(mào)易有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室廖月葵高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為山茶科植物大葉金花茶Camelliachrysantha(Hu) Tuyama var.macrophyllaS. L. Mo et S. Z. Huang的干燥葉片。辛伐他汀購(gòu)自廈門力卓藥業(yè)有限公司，批號(hào)181105。

1.3 試劑 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、Accutase膠原酶細(xì)胞解離液、Pen Strep青鏈霉素混合液(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)2120425、1828728、8117266、1952692、1881461)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)、FBS培養(yǎng)基、ECGS培養(yǎng)基、P/S Solution培養(yǎng)基(美國(guó)Scien Cell公司，批號(hào)28755、29009、29065、28331)；CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)DV652)；蛋白電泳預(yù)制膠(南京金斯瑞生物科技有限公司，批號(hào)C35252003)；ox-LDL、組織細(xì)胞裂解液、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)H7980、20190903、20190910、20190909)；Image-iT 細(xì)胞固定與透化試劑盒(美國(guó)Life Technologies公司，批號(hào)1968179)；小鼠抗人CD14- Alexa Fluor 488單抗(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)2016143)；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單抗(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)GR202362-1)；兔抗人ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin單抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)02、02、01、05)；HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號(hào)G218AA0001]。

1.4 儀器 細(xì)胞共培養(yǎng)板(無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司，批號(hào)071719XS01)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司)；冷凍干燥儀(美國(guó)IXRF公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；5430R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；LSR Fortessa多色分析流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Mini-PROTEAN垂直電泳儀、Mini Trans-blot轉(zhuǎn)印儀、Chemi Doc成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；ASP300S全自動(dòng)組織脫水機(jī)、RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、EG1150H石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

2 方法

2.1 THP-1人單核細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞的體外培養(yǎng) THP-1細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基，HUVEC細(xì)胞采用ECM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，均添加10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素，初始細(xì)胞密度2×105/mL，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、5%CO2、飽和濕度，細(xì)胞長(zhǎng)至約70%時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.2 提取物制備 準(zhǔn)確稱取500 g金花茶葉，粉碎后過40目篩。先后以10、8倍量75%乙醇回流提取各1次(時(shí)間分別為2、1.5 h)，合并提取液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀與水浴鍋除去醇味，所得膏狀物用冷凍干燥儀干燥成為固態(tài)干粉，稱取干粉質(zhì)量后折算為生藥量，最終每1 g固態(tài)干粉狀提取物相當(dāng)于生藥13.53 g，密閉置于干燥容器內(nèi)，在-40 ℃下冷凍保存，臨用時(shí)以蒸餾水稀釋后使用。

2.3 提取物含藥血清、空白對(duì)照血清制備 10只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為空白對(duì)照組3只，每天灌胃給予蒸餾水2 mL，連續(xù)7 d；給藥組7只，每天灌胃給予金花茶葉提取物(生藥量0.8 g/kg)，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，下腔動(dòng)脈穿刺采血，分離血清，56 ℃滅活30 min，分裝后在-40 ℃下冷凍保存[6-8]。

2.4 提取物含藥血清、空白對(duì)照血清的細(xì)胞安全性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞，初始密度2×105/mL，分別設(shè)置添加10% FBS的正常組和添加5%、10%、15%、20%金花茶葉含藥血清或空白血清的給藥組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度，以正常組為100%細(xì)胞增殖活性，計(jì)算給藥組細(xì)胞增殖活性。

2.5 提取物含藥血清干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC趨化單核細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC與THP-1單核細(xì)胞，設(shè)置正常組、模型組、空白血清組、金花茶葉含藥血清組，給藥組根據(jù)細(xì)胞安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇適宜濃度，并對(duì)HUVEC細(xì)胞進(jìn)行24 h孵育預(yù)處理，而正常組和模型組不作預(yù)處理。預(yù)處理結(jié)束后，加入100 μg/mL ox-LDL孵育24 h，更換新鮮培養(yǎng)液，取細(xì)胞共培養(yǎng)板，上層接種THP-1單核細(xì)胞，下層接種HUVEC細(xì)胞，共同培養(yǎng)24 h，分別收獲上下層所有細(xì)胞，用于流式細(xì)胞術(shù)分析或總蛋白提取[9]。

2.6 提取物減輕動(dòng)脈粥樣硬化的體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn) 采用高脂飼料飼喂ApoE基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠以復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，8只C57BL/6JGpt雄性小鼠作為正常組，飼喂小鼠正常飼料；24只ApoE-/-雄性小鼠分為模型組、辛伐他汀組、金花茶葉提取物組，每組8只，給予高脂飼料(含21%脂肪和0.15%膽固醇)喂養(yǎng)8周。從第9周開始，在原有飼喂方式的基礎(chǔ)上，正常組、模型組小鼠每天灌胃給予蒸餾水2 mL，辛伐他汀組小鼠每天灌胃給予藥物10 mg/kg，金花茶葉提取物組每天灌胃給予提取物5 g/kg，連續(xù)8周。第16周末，各組小鼠脫頸椎處死，迅速剖胸切取主動(dòng)脈弓，一部分主動(dòng)脈弓縱向剖開并仔細(xì)分離動(dòng)脈內(nèi)膜，將內(nèi)膜置于-80 ℃下冷凍保存，另一部分主動(dòng)脈弓于10%中性甲醛固定[10-11]。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVEC+單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的單核細(xì)胞數(shù)目占比 收集處理完畢的細(xì)胞，以膠原酶細(xì)胞解離液室溫處理10 min使其解離為單個(gè)細(xì)胞，Image-it Fix-Perm kit進(jìn)行細(xì)胞固定處理，加入1∶1 000稀釋的小鼠抗人CD14-Alexa Fluor 488單抗，在4 ℃下避光孵育120 min，4 ℃預(yù)冷的PBS輕柔洗滌3次，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

2.8 免疫印跡法檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin蛋白表達(dá) 收集處理完畢的細(xì)胞與主動(dòng)脈弓內(nèi)膜組織(盡量剪碎)，裂解液4 ℃裂解處理30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清并進(jìn)行蛋白定量，上樣量為20 μg，恒壓100 V條件下電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉，ICAM-1(1∶1 200)、VCAM-1(1∶1 000)、MCP-1(1∶1 000)、P-selectin(1∶1 200)、GAPDH(1∶1 300)一抗4 ℃孵育過夜，次日二抗(1∶2 000)室溫孵育60 min，超敏化學(xué)發(fā)光液孵育3 min，即以ChemiDoc成像系統(tǒng)成像。

2.9 小鼠主動(dòng)脈弓組織動(dòng)脈粥樣硬化斑塊觀察 取10%中性甲醛固定的小鼠主動(dòng)脈弓，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟至水，HE染色，中性樹膠封片，在光鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 HUVEC、THP-1細(xì)胞形態(tài)觀察 HUVEC細(xì)胞每4～5 d以1∶3比例傳代1次，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，顯微鏡下可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，部分呈不規(guī)則多邊形；THP-1細(xì)胞每3～4天以1∶3比例傳代1次，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，顯微鏡下細(xì)胞呈圓形，有聚集生長(zhǎng)的趨勢(shì)，見圖1。

3.2 細(xì)胞安全性實(shí)驗(yàn) 與正常組(10%胎牛血清)比較，5%、10%金花茶葉含藥血清或空白血清組HUVEC細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，而15%、20%金花茶葉含藥血清或空白血清組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2。因此，選擇10%作為后續(xù)血清藥理實(shí)驗(yàn)的適宜濃度。

3.3 金花茶葉提取物含藥血清抑制HUVEC趨化單核細(xì)胞 正常組單核細(xì)胞比例為(1.14±0.26)%，與正常組比較，模型組HUVEC的趨化單核細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)，為(12.77±0.15)%；與模型組比較，金花茶葉含藥血清組、空白血清組可見HUVEC趨化單核細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)差異化的變化趨勢(shì)，其中前者減少(P<0.01)，為(2.67±0.36)%，后者無(wú)明顯變化(P>0.05)，為(12.87±0.06)%，見圖3A～3B。金花茶葉提取物含藥血清了抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin蛋白過表達(dá)，見圖3C～3D。

3.4 金花茶葉提取物抑制動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的粥樣斑塊形成 正常組未見粥樣斑塊形成，內(nèi)膜表面光滑，各層次結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞與組織結(jié)構(gòu)正常，主動(dòng)脈管腔無(wú)縮窄；模型組可見較大的向管腔內(nèi)明顯突出的粥樣硬化斑塊形成，主動(dòng)脈管腔有不同程度縮窄，內(nèi)膜表面欠光滑，粥樣斑塊內(nèi)可見典型泡沫細(xì)胞，有明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粥樣斑塊與內(nèi)膜下肌層分界不清，部分肌纖維斷裂；辛伐他汀組主動(dòng)脈弓內(nèi)膜鏡下所見接近正常組，僅有輕微炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未見粥樣斑塊形成；金花茶葉提取物組可見較小的向管腔內(nèi)輕微突出的粥樣斑塊形成，主動(dòng)脈管腔內(nèi)膜表面尚光滑，各層次結(jié)構(gòu)基本完整，粥樣斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞較少，炎細(xì)胞輕度浸潤(rùn)，粥樣斑塊與內(nèi)膜下肌層分界不清但未見肌纖維斷裂，見圖4A。金花茶葉提取物抑制動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的動(dòng)脈內(nèi)膜ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin蛋白過表達(dá)，見圖4B～4C。

4 討論

以中醫(yī)學(xué)的脾胃學(xué)說(shuō)解析動(dòng)脈粥樣硬化的慢性低度血管內(nèi)皮炎癥，應(yīng)為元?dú)馓撍セA(chǔ)上發(fā)生的“內(nèi)熱”[12]，但動(dòng)脈粥樣硬化患者的內(nèi)熱異于尋常所見的陽(yáng)火?？嗪穫⑽戈?yáng)氣，瀉下之品亦可加重元?dú)馓澨?，?dòng)脈粥樣硬化的陰火內(nèi)熱之證不適用苦寒瀉火的治則，而金花茶葉清熱解毒，可用于解除陰火內(nèi)熱，以其性平，可避免苦寒耗損脾胃陽(yáng)氣的弊端，適用于動(dòng)脈粥樣硬化早期防治的中醫(yī)藥干預(yù)。

研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化局部的內(nèi)皮源性一氧化氮(nitic oxide, NO)、前列腺素、血小板源性生長(zhǎng)因子、ox-LDL、血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素的生理平衡被破壞，內(nèi)皮細(xì)胞異常高表達(dá)P-selectin、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等粘附分子，促進(jìn)單核細(xì)胞在局部?jī)?nèi)皮的粘附，遷移至內(nèi)皮下并進(jìn)而分化為成熟的巨噬細(xì)胞，加重局部炎癥損傷，增加LDL的局部沉積及氧化修飾，構(gòu)成ox-LDL與炎癥反應(yīng)的自加強(qiáng)循環(huán)[13]。因此，動(dòng)脈粥樣硬化是一種與糖脂代謝異常、脂質(zhì)氧化修飾密切相關(guān)的慢性低度血管內(nèi)皮炎癥[14-15]。金花茶葉兼具改善糖脂代謝異常、減輕血管內(nèi)皮炎癥、抑制脂質(zhì)氧化修飾等多種藥理活性，可有效遏制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的啟動(dòng)與進(jìn)展，在早期防治領(lǐng)域具有潛在積極意義[16]。

本研究以ox-LDL刺激HUVEC細(xì)胞成功誘導(dǎo)過表達(dá)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin，類似改變也出現(xiàn)在高脂飲食飼喂的ApoE-/-雄性小鼠的主動(dòng)脈弓內(nèi)膜組織，提示ox-LDL確為血管內(nèi)皮過表達(dá)粘附與趨化分子的重要危險(xiǎn)因素[17]。有研究證實(shí)，金花茶葉/金花茶葉提取物有降低LDL作用，并且具有較高的安全劑量范圍，然而其作用強(qiáng)度顯然不及他汀類藥物，也沒有直接比較兩者調(diào)節(jié)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin在血管內(nèi)皮表達(dá)的研究報(bào)道[18]。體外實(shí)驗(yàn)的藥效考察體系僅能檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞與含藥血清的直接相互作用，缺乏與之相關(guān)的其他細(xì)胞、組織的調(diào)控作用的參與，導(dǎo)致金花茶葉提取物的體內(nèi)藥效明顯優(yōu)于體外藥效，該現(xiàn)象也是許多天然藥物體內(nèi)外藥效差異的常見原因[19]。然而，模式動(dòng)物在金花茶葉提取物干預(yù)的情況下仍然出現(xiàn)了輕度的動(dòng)脈粥樣斑塊病變，表明單獨(dú)使用金花茶葉或其提取物可能不足以充分阻止動(dòng)脈粥樣硬化粥樣斑塊形成，但其顯著的安全性使其極為適合用于廣泛人群的動(dòng)脈粥樣硬化日常預(yù)防。對(duì)于不能耐受他汀類藥物的人群，金花茶葉或其提取物則具有更為顯著的應(yīng)用價(jià)值。

獲取人體早期動(dòng)脈粥樣硬化的病理標(biāo)本是非常困難的，因而對(duì)其各階段的研究需不斷深化[20-21]。動(dòng)脈粥樣硬化研究使用的動(dòng)物與人類存在諸多差異，本研究使用的高脂飼料飼喂ApoE-/-雄性小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型亦難以避免，故今后仍應(yīng)進(jìn)行臨床研究[22]。