腹炎消通過調(diào)控Notch2/Hes-1通路對重癥胰腺炎大鼠急性肺損傷的影響

陳玉梅， 楊 靜， 蘇 淼， 董 梁， 王麗華

(衡水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 衡水 053000)

重癥急性胰腺炎是一種嚴重的胰腺炎性疾病，可以從胰腺的局部損傷發(fā)展為全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征[1]。急性肺損傷是重癥急性胰腺炎最嚴重的并發(fā)癥之一，可導致急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)展并導致高死亡率[2]。目前，重癥急性胰腺炎相關(guān)急性肺損傷的主要治療方法是藥物治療，但治療藥物有限，效果不令人滿意，故開發(fā)新的有效治療藥物至關(guān)重要。根據(jù)重癥急性胰腺炎的發(fā)病部位及臨床特點，中醫(yī)將其歸屬于“脾心痛”“胰癉”范疇，其基本病機為腑氣不通，瘀毒內(nèi)蘊[3]。中醫(yī)藥治療急性胰腺炎是我國臨床特色，不少中藥方劑及其提取物具有治療重癥急性胰腺炎，并減輕與其相關(guān)急性肺損傷的功效[4-5]。腹炎消由大黃、連翹、蒲公英、銀花、厚樸、炒萊菔子、桃仁、紅花、敗醬草等組成，具有通里攻下、清熱解毒、行氣消積、消腫散癰的功效，但其對重癥急性胰腺炎及其并發(fā)癥急性肺損傷是否具有保護作用尚不清楚。因此，本研究通過建立重癥急性胰腺炎大鼠模型，觀察腹炎消對其并發(fā)癥急性肺損傷的影響并初步探討其機制，為重癥急性胰腺炎及其并發(fā)癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠76只，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，購自河北伊維沃生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK(冀)2020-002。飼養(yǎng)環(huán)境為相對濕度45%～55%，溫度(20±2)℃，12 h/12 h光照/黑暗，自由獲取食物和水。本研究中涉及活體動物的所有實驗程序均經(jīng)衡水市人民醫(yī)院倫理委員會批準，并嚴格遵守《實驗動物的護理和使用指南》的指導原則進行。

1.2 藥物制備 腹炎消由蒲公英30 g，銀花30 g，厚樸12 g，炒萊菔子30 g，桃仁12 g，連翹12 g，薏苡仁30 g，甘草6 g，敗醬草30 g，元胡15 g，白芍15 g，姜半夏10 g，黃芩15 g，柴胡15 g，生大黃15 g(后下)組成，上述藥材經(jīng)衡水市人民醫(yī)院趙衛(wèi)國主任中醫(yī)師鑒定為正品，加入8倍量的水充分浸泡30 min，煎煮40 min，過濾藥液，藥渣再加入6倍量的水繼續(xù)煎煮40 min，過濾藥液，合并2次藥液，煎煮濃縮至1 mL，相當于生藥2 g/mL。

1.3 試劑 3.5%?；悄懰徕c、DAPT(γ-分泌酶抑制劑，可抑制Notch信號通路)(貨號T7515、D5942)購自美國Sigma-Aldrich公司；HE染色試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒(貨號C0105、P0013B、P0010)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)ELISA檢測試劑盒(貨號RA20607、RA20035、RA20614)均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；淀粉酶(amylase，AMY)檢測試劑盒(貨號C016-1-1)購自南京建成生物工程研究所；RT-qPCR引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計和合成；兔源一抗Hes家族BHLH轉(zhuǎn)錄因子1(Hes family BHLH transcription factor 1，Hes-1)、Notch2、β-actin、HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L)(貨號PA5-28802、PA5-87455、MA5-32479、65-6120)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 儀器 ABL90 FLEX血氣分析儀(丹麥Radiometer公司)；iMark680多功能酶標儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)；BX51電動顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 模型建立 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機選取12只作為假手術(shù)組，其余64只采用3.5%牛磺膽酸鈉誘導重癥急性胰腺炎[6-7]。大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水，用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，暴露腹腔，在腹部切開1個切口，將胰十二指腸分離到十二指腸內(nèi)側(cè)后，用金屬夾夾住胰膽管，將4.5號針逆行刺進距十二指腸壁2 mm的胰膽管，然后用無創(chuàng)金屬夾夾住十二指腸側(cè)的胰管，使用微量輸液泵將3.5%牛磺膽酸鈉逆行注射入胰膽管(1 mL/kg，6 mL/h)誘導大鼠重癥急性胰腺炎，觀察大鼠胰腺變化，當確認胰腺囊膜下出現(xiàn)明顯水腫和出血時，則說明造模成功；假手術(shù)組大鼠以相同的方式注射等量生理鹽水。術(shù)后縫合大鼠腹部，未成功造模大鼠有4只，模型建立成功率為93.75%。

2.2 分組及給藥 將造模成功的60只大鼠隨機分為模型組，DAPT組，腹炎消低、高劑量組，腹炎消+DAPT組，每組12只。術(shù)后12 h，DAPT組大鼠腹腔注射5 mg/kg DAPT(溶于生理鹽水)[8]，腹炎消低、高劑量組大鼠灌胃給予17.8、35.6 g/kg腹炎消水煎液(相當于臨床劑量1、2倍)，腹炎消+DAPT組大鼠腹腔注射5 mg/kg DAPT 30 min后，灌胃給予35.6 g/kg腹炎消水煎液，24 h后到達實驗終點。

2.3 大鼠肺功能檢測 大鼠麻醉后腹主動脈取血，立即使用血氣分析儀測定動脈血中氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)，計算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)。本實驗大鼠吸入空氣(氧氣體積分數(shù)21%)，故吸入氧氣濃度(FiO2)為0.21。

2.4 血清AMY活性檢測 全血1 500 r/min離心10 min，分離得到血清，按照試劑盒說明書，采用碘-淀粉比色法檢測血清AMY活性。

2.5 肺組織濕/干質(zhì)量比檢測 取大鼠右肺中葉，生理鹽水沖洗殘留血跡后，濾紙吸干表面水分，稱定質(zhì)量，獲得肺濕質(zhì)量，然后將肺組織在60 ℃下烘烤48 h后稱定質(zhì)量，獲得干質(zhì)量，計算濕/干質(zhì)量比。

2.6 ELISA法檢測肺組織炎性因子水平 將剩余右肺組織，以1∶9比例加入預(yù)冷生理鹽水，制備10%組織勻漿，研磨后離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測勻漿液中TNF-α、IL-6、ICAM-1水平。

2.7 HE染色觀察胰腺、肺組織病理學變化 取出大鼠胰腺和肺組織，將左側(cè)肺組織分為兩部分，一部分放入凍存管中，液氮速凍后，移至-80 ℃冰箱保存，另一部分肺組織和胰腺組織于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察胰腺和肺組織的病理學變化。肺組織病理評分標準為(1)肺泡腔內(nèi)是否有出血、充血；(2)肺泡壁或者血管壁中是否有炎性細胞聚集；(3)肺泡壁是否有明顯增厚，上述每一項按照損傷的嚴重程度分為0分，無以上病理損傷；1分，局部有輕微損傷；2分，有中等損傷且局部顯著；3分，有嚴重且廣泛的損傷。胰腺組織病理評分標準見表1。

表1 胰腺組織病理評分標準

2.8 免疫組化法檢測肺組織Notch2、Hes-1蛋白表達 取“2.7”項下石蠟切片，使用微波在檸檬酸鈉緩沖液中進行抗原修復(fù)，3% H2O2封閉非特異性抗體結(jié)合位點，滴加一抗Notch2、Hes-1(1∶200)于4 ℃孵育過夜，洗去一抗后與HRP標記的山羊抗兔IgG于37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，在顯微鏡下觀察和拍照。棕黃色或棕褐色沉積為陽性表達，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行光密度(OD)值分析，每張切片選擇3個不同區(qū)域，結(jié)果取平均值。

2.9 RT-qPCR法檢測肺組織Notch2、Hes-1 mRNA表達 取-80 ℃冰箱保存的肺組織，使用TRIzol試劑提取總RNA，分光光度計測定總RNA濃度，使用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)，根據(jù)擴增試劑盒的說明，進行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為Premix Ex TaqTM(2×)10 μL、正反向引物各0.8 μL，cDNA(200 ng/μL)2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性18 s，60 ℃退火55 s，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次。采用2-ΔΔCT法，β-actin為內(nèi)參，計算Notch2、Hes-1 mRNA相對表達。引物序列見表2。

表2 引物序列

3 結(jié)果

3.1 腹炎消對重癥急性胰腺炎大鼠肺功能的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PaO2、PaO2/FiO2降低(P<0.05)，PaCO2升高(P<0.05)；與模型組比較，DAPT組和腹炎消各劑量組大鼠PaO2、PaO2/FiO2升高(P<0.05)，PaCO2降低(P<0.05)；與DAPT組和腹炎消高劑量組比較，腹炎消+DAPT組PaO2、PaO2/FiO2升高(P<0.05)，PaCO2降低(P<0.05)，見表3。

表3 腹炎消對大鼠肺功能的影響

3.2 腹炎消對重癥急性胰腺炎大鼠血清AMY活性和肺組織濕/干質(zhì)量比的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AMY活性、肺組織濕/干質(zhì)量比升高(P<0.05)；與模型組比較，DAPT組和腹炎消各劑量組大鼠血清AMY活性、肺組織濕/干質(zhì)量比降低(P<0.05)；與DAPT組和腹炎消高劑量組比較，腹炎消+DAPT組大鼠血清AMY活性、肺組織濕/干質(zhì)量比降低(P<0.05)，見表4。

表4 腹炎消對大鼠血清AMY活性和肺組織濕/干質(zhì)量比的影響

3.3 腹炎消對重癥急性胰腺炎大鼠肺組織TNF-α、IL-6、ICAM-1水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織勻漿液中TNF-α、IL-6、ICAM-1水平升高(P<0.05)；與模型組比較，DAPT組和腹炎消各劑量組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、ICAM-1水平降低(P<0.05)；與DAPT組和腹炎消高劑量組比較，腹炎消+DAPT組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、ICAM-1水平降低(P<0.05)，見表5。

表5 腹炎消對大鼠肺組織TNF-α、IL-6、ICAM-1水平的影響

3.4 腹炎消對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺、肺組織病理學變化的影響 假手術(shù)組大鼠胰腺和肺組織沒有明顯的病理形態(tài)學變化；模型組大鼠胰腺組織細胞壞死、胞質(zhì)空泡、水腫嚴重、炎性細胞浸潤，肺組織有炎性細胞浸潤，出血，肺泡間隔增厚，與假手術(shù)組比較，胰腺和肺組織損傷病理評分增加(P<0.05)；與模型組比較，DAPT組和腹炎消各劑量組大鼠胰腺和肺組織上述病理損傷減輕，炎性細胞浸潤減少，胰腺和肺組織損傷病理評分降低(P<0.05)；與DAPT組和腹炎消高劑量組比較，腹炎消+DAPT組大鼠胰腺和肺組織上述病理損傷進一步減輕，胰腺和肺組織損傷病理評分降低(P<0.05)，見圖1、表6。

表6 腹炎消對大鼠胰腺和肺組織病理評分的影響(分，

3.5 腹炎消對重癥急性胰腺炎大鼠肺組織Notch2、Hes-1蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織Notch2、Hes-1蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，DAPT組和腹炎消各劑量組大鼠肺組織Notch2、Hes-1蛋白表達降低(P<0.05)；與DAPT組和腹炎消高劑量組比較，腹炎消+DAPT組大鼠肺組織Notch2、Hes-1蛋白表達降低(P<0.05)，見圖2、表7。

表7 腹炎消對大鼠肺組織Notch2、Hes-1蛋白表達的影響(OD值，

3.6 腹炎消對重癥急性胰腺炎大鼠肺組織Notch2、Hes-1 mRNA表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織Notch2、Hes-1 mRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，DAPT組和腹炎消低、高劑量組大鼠肺組織Notch2、Hes-1 mRNA表達降低(P<0.05)；與DAPT組和腹炎消高劑量組比較，腹炎消+DAPT組大鼠肺組織Notch2 mRNA和Hes-1 mRNA表達降低(P<0.05)，見表8。

表8 腹炎消對重癥急性胰腺炎大鼠肺組織Notch2、Hes-1 mRNA表達的影響

4 討論

近年來研究證明，中醫(yī)藥治療重癥急性胰腺炎可改善患者癥狀，減少并發(fā)癥，防止復(fù)發(fā)[9-10]。祖國醫(yī)學認為重癥急性胰腺炎應(yīng)以“益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、活血化瘀、通里攻下”為主要治則。腹炎消方中生大黃、連翹、蒲公英、銀花有清熱解毒、消腫散結(jié)、蕩滌腸胃的功效，且大黃可促進肺泡巨噬細胞凋亡，抑制炎癥因子分泌，減輕重癥急性胰腺炎大鼠肺部炎癥[11]；大黃素可抑制NLRP3炎性小體活化，并抑制肺組織中NF-κB核積累，保護大鼠免受重癥急性胰腺炎相關(guān)肺損傷[12-13]。厚樸、炒萊菔子可行氣消積、消食除脹、降逆平喘；厚樸酚能減輕重癥急性胰腺炎大鼠急性肺損傷[5]。桃仁、紅花可活血祛瘀、活血通經(jīng)、散瘀止痛，也是治療重癥急性胰腺炎方劑中的常用中藥[14]；桃仁提取物對急性胰腺炎大鼠腸道屏障功能具有保護作用[15]。薏苡仁清熱利濕、排膿消腫，敗醬草清熱解毒、消癰排膿、祛瘀止痛，何俊余等[16]發(fā)現(xiàn)在大承氣湯的基礎(chǔ)上加薏苡仁、敗醬草治療急性胰腺炎，契合其邪實熱盛、腑氣不通、熱毒熾盛、血敗肉腐以致成癰的病機。因此，腹炎消可能是減輕與重癥急性胰腺炎相關(guān)急性肺損傷的有效方劑。

TNF-α、IL-6是重癥急性胰腺炎嚴重程度和預(yù)后評估的早期指標[13]；ICAM-1在重癥急性胰腺炎相關(guān)急性肺損傷中表達升高，是預(yù)測嚴重病程的良好標志物，并且TNF-α與ICAM-1在急性肺損傷的病程中可相互促進[17-18]；血清AMY活性是診斷急性胰腺炎的重要指標[19]。在本研究中，重癥急性胰腺炎模型大鼠PaO2、PaO2/FiO2降低，PaCO2，血清AMY活性，肺組織濕/干質(zhì)量比，肺組織TNF-α、IL-6、ICAM-1水平升高，說明模型大鼠肺功能受損，肺組織出現(xiàn)嚴重炎癥反應(yīng)。經(jīng)腹炎消干預(yù)后，大鼠的血氧狀態(tài)明顯改善，血清AMY活性、肺組織濕/干質(zhì)量比和肺組織炎性因子水平降低，且胰腺和肺組織水腫、炎性細胞浸潤和出血等病理損傷減輕，提示腹炎消可降低肺部炎癥反應(yīng)，改善重癥急性胰腺炎大鼠肺功能。

Notch/Hes通路調(diào)控炎癥細胞的凋亡，Notch2廣泛表達于血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞和間質(zhì)成纖維細胞，參與早期肺部發(fā)育[20]；Hes-1是Notch2的效應(yīng)子，在肢體缺血/再灌注誘發(fā)肺損傷后Notch2被激活，位于下游的Hes-1上調(diào)，刺激炎性細胞因子釋放，導致肺損傷[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在重癥急性胰腺炎早期肺組織中Notch/Hes1通路被激活，可導致下游IL-6、TNF-α上調(diào)，與急性肺損傷的進展密切相關(guān)[22]。Notch2的敲低對肺組織具有保護作用，DAPT可通過抑制Notch通路減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷[23-24]。本研究結(jié)果顯示，DAPT和腹炎消干預(yù)均可降低重癥急性胰腺炎大鼠肺組織Notch2和Hes-1表達，且兩者聯(lián)合應(yīng)用后，Notch2和Hes-1表達較單獨使用降低，說明腹炎消可抑制Notch2/Hes-1通路的激活。

綜上所述，腹炎消可降低大鼠肺部炎癥，改善與重癥急性胰腺炎相關(guān)的急性肺損傷，其機制可能與抑制Notch2/Hes-1通路的激活有關(guān)。