益腎化濕顆粒對(duì)抗Thy-1型腎炎大鼠腎組織中PCNA、Akt表達(dá)的影響

董王鈺， 楊 銳， 張春江， 許曉剛， 陶 林,2， 楊曉萍*

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN) 是全球最常見(jiàn)的腎小球腎炎類(lèi)型之一[1]，其基本病理特征為腎小球系膜細(xì)胞增殖和/或系膜細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多[2]。有研究表明，隨著系膜細(xì)胞增生程度的加重，蛋白尿、總膽固醇、甘油三脂可隨之升高，并伴隨血清白蛋白的降低[3]。因此，抑制系膜細(xì)胞增殖對(duì)改善MsPGN腎功能、延緩病程進(jìn)展至關(guān)重要。既往研究表明，益腎化濕顆粒具有抑制氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、增殖的作用[4-5]。因此，本研究通過(guò)建立不可逆性抗Thy-1型MsPGN大鼠模型，觀察腎組織病理變化，檢測(cè)血清腎功能相關(guān)指標(biāo)以及腎組織中PCNA、Akt蛋白和mRNA表達(dá)，探索益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN疾病的治療作用及調(diào)控機(jī)制，并探討其與增殖的關(guān)系。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，6周齡，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(新)2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(新)2018-0003。大鼠飼養(yǎng)屏障環(huán)境為溫度(23±3)℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)石河子大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2020院倫理實(shí)字(177)號(hào)(No.01)]。

1.2 試劑與藥物 益腎化濕顆粒(批號(hào)20200503，10 g/袋)購(gòu)自廣州康臣藥業(yè)有限公司，完全溶解于45 ℃生理鹽水中，配制成500 mg/mL藥液備用；纈沙坦分散片(批號(hào)20210112，80 mg/片)購(gòu)自海南皇隆制藥股份有限公司，研磨成粉后溶解于45 ℃生理鹽水中，配制成2 mg/mL藥液。兔抗大鼠Thy1多克隆抗體、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)(貨號(hào)bs-6951R)、p-Akt (Thr308)(貨號(hào)bs-2720R)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)(貨號(hào)bs-2007R)抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；尿蛋白定量測(cè)試盒(批號(hào)C035-2-1)購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；山羊抗兔IgG H&L (HRP)(貨號(hào)ab205718)、山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(貨號(hào)ab205719)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin抗體(批號(hào)100166-MM10)購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；顯微鏡(日本尼康公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模、分組與給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、纈沙坦組(8.5 mg/kg)及益腎化濕顆粒低、高劑量組(3.125、6.25 g/kg)，每組12只，均行左腎切除術(shù)，7 d后，除空白組外，其余4組大鼠均經(jīng)尾靜脈單次注射2 mg/kg Thy-1抗體，建立不可逆性MsPGN大鼠模型，空白組尾靜脈單次注射等體積生理鹽水。造模完成后，各給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)6周。

2.2 樣本采集 于第7、42天灌胃結(jié)束后，隨機(jī)各取6只大鼠，使用代謝鼠籠收集24 h尿液，4 ℃、1 500 r/min離心5 min，取上清液?jiǎn)为?dú)分裝，保存于-80 ℃冰箱；于第8、43天，將大鼠固定于操作臺(tái)，麻醉后開(kāi)腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血4 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液(即血清)單獨(dú)分裝，保存于-80 ℃冰箱；大鼠取血完畢后處死，完整摘取右側(cè)腎臟組織，一部分固定于4%多聚甲醛，另一部分液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 24 h尿蛋白定量檢測(cè) 采用尿蛋白定量測(cè)試盒檢測(cè)24 h尿蛋白水平。

2.4 血清肌酐、尿素氮水平檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐、尿素氮水平。

2.5 腎組織病理變化觀察 取于第8、43天固定的腎組織樣本，經(jīng)乙醇脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切成4 μm薄片，分別進(jìn)行HE、Masson染色，顯微鏡下觀察并拍照，并對(duì)病理病變進(jìn)行腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生程度、腎間質(zhì)纖維化程度分級(jí)進(jìn)行量化評(píng)分[6-7]。

2.6 Western blot法檢測(cè)大鼠腎組織PCNA、Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 取適量于第43天冷凍保存的腎組織，裂解后提取總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，使用脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗PCNA(1∶500)、Akt(1∶500)、p-Akt (Thr308)(1∶500)、β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育16 h，洗膜后加入二抗孵育2 h，洗膜后顯色定影，采用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.7 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠腎組織PCNA、AktmRNA表達(dá) 取適量于第43天冷凍保存的腎組織，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR分析，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共循環(huán)40次。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 空白組大鼠反應(yīng)較靈敏，精神狀態(tài)佳，進(jìn)食正常；其余各組造模后精神不振，進(jìn)食量減少。連續(xù)給藥治療6周后，給藥組大鼠精神狀態(tài)及進(jìn)食量?jī)?yōu)于模型組，各給藥組間大鼠精神狀態(tài)及進(jìn)食量無(wú)明顯差異。第43天對(duì)各組大鼠體質(zhì)量進(jìn)行記錄，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組大鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)，纈沙坦組大鼠體質(zhì)量增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各給藥組間體質(zhì)量差異無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 益腎化濕顆粒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

3.2 益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN腎炎大鼠24 h尿蛋白定量的影響 第7天，各組大鼠24 h尿蛋白水平比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。第42天，與空白組比較，模型組24 h尿蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組及纈沙坦組24 h尿蛋白水平降低(P<0.05)；各給藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 益腎化濕顆粒對(duì)大鼠24 h尿蛋白定量的影響

3.3 益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN腎炎大鼠腎功能的影響 第8天，與空白組比較，模型組大鼠血清肌酐水平升高(P<0.01)，尿素氮水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組尿素氮水平降低(P<0.05)，血清肌酐水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第43天，與空白組比較，模型組血清肌酐、尿素氮水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組血清肌酐、尿素氮水平均降低(P<0.05)；各給藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 益腎化濕顆粒對(duì)大鼠腎功能的影響

3.4 益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN腎炎大鼠腎組織病理變化的影響 第8天，空白組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，僅出現(xiàn)極其輕微的系膜細(xì)胞增生以及腎間質(zhì)纖維化，未觀察到毛細(xì)血管腔受擠壓的情況；與空白組比較，模型組大鼠腎組織系膜細(xì)胞與系膜基質(zhì)呈現(xiàn)彌漫性增生，毛細(xì)血管管腔部分受到擠壓，出現(xiàn)輕度狹窄，提示Thy-1型腎炎大鼠模型制備成功。與空白組比較，模型組大鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生程度評(píng)分、腎間質(zhì)纖維化評(píng)分均升高(P<0.05)；各給藥組與模型組比較2項(xiàng)評(píng)分均無(wú)明顯變化(P>0.05)。第43天，模型組大鼠腎組織系膜細(xì)胞、基質(zhì)增生、腎間質(zhì)纖維化較空白組嚴(yán)重，2項(xiàng)評(píng)分均高于空白組(P<0.05)；各給藥組大鼠腎組織系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎間質(zhì)纖維化程度較模型組改善，2項(xiàng)評(píng)分均低于模型組(P<0.05)；各給藥組各評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1、表5。

表5 益腎化濕顆粒對(duì)大鼠腎組織病理變化的影響(分，

3.5 益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN腎炎大鼠腎組織PCNA、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織PCNA、p-Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，益腎化濕高劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織PCNA、p-Akt蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；各組大鼠腎組織Akt蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2～3。

3.6 益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN腎炎大鼠腎組織PCNA、AktmRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織PCNAmRNA表達(dá)升高(P<0.05)，AktmRNA表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織PCNA、AktmRNA表達(dá)降低(P<0.05)；各給藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表6 益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN腎炎大鼠腎組織PCNA、Akt mRNA表達(dá)的影響

4 討論

目前MsPGN治療藥物主要包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等[8]。根據(jù)該疾病本虛標(biāo)實(shí)之證[9-10]，多數(shù)醫(yī)家主張使用益氣滋腎、清利濕熱等方醫(yī)治[11]。益腎化濕顆粒是以黃芪、人參為君藥，黃芪等為臣藥的16味中藥組方[12]，具有升陽(yáng)補(bǔ)脾、益腎化濕功效，用于脾虛濕盛證所致蛋白尿等，對(duì)癥MsPGN。本研究結(jié)果顯示，益腎化濕顆?？稍黾哟笫篌w質(zhì)量，降低24 h尿蛋白水平，改善腎功能，提示對(duì)MsPGN有治療作用。同時(shí)，病理結(jié)果表明，益腎化濕顆粒能減輕腎小球系膜細(xì)胞增生及基質(zhì)增多，提示其可減輕腎臟病理?yè)p傷。

PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白[13]，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的常用指標(biāo)之一[14]。有研究證實(shí)，在大鼠抗Thy-1腎炎模型造模后第1天，腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)PCNA表達(dá)上調(diào)，提示PCNA能較早反映腎小球系膜細(xì)胞的增殖狀況[15]。本研究證明，益腎化濕顆粒可降低PCNA蛋白和mRNA表達(dá)，提示其可能通過(guò)抑制PCNA表達(dá)，減少處于增殖狀態(tài)的腎小球系膜細(xì)胞，延緩MsPGN進(jìn)展。

PI3K/Akt信號(hào)通路在腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[16-17]。有研究表明，通過(guò)抑制該信號(hào)通路可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，各組間Akt mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，益腎化濕顆粒高劑量組p-Akt蛋白表達(dá)低于模型組，這可能是由于Akt被磷酸化修飾為p-Akt后具有生物活性[19]，有研究顯示，p-Akt可參與抗Thy-1腎炎模型中系膜增生的啟動(dòng)和進(jìn)展[20]，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，益腎化濕顆粒能改善MsPGN大鼠蛋白尿、腎功能及腎組織病理?yè)p傷，從而保護(hù)腎臟功能，延緩腎臟病變，其機(jī)制可能與抑制PCNA、p-Akt表達(dá)有關(guān)。本研究為益腎化濕顆粒治療MsPGN的相關(guān)機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。