基于標準湯劑的槲寄生配方顆粒質(zhì)量標準研究

張智遠， 丁 潔， 曹桂云， 李媛媛， 耿紹軒， 孟兆青*， 劉玉紅,3*

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250103；3.山東省高校中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟南 250355)

槲寄生為桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥帶葉莖枝[1-2]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用，而且不良反應(yīng)少，來源廣泛，開發(fā)價值高[3-5]。

中藥配方顆粒以炮制規(guī)范的單味中藥材為原材料，充分運用現(xiàn)代工藝進行制備，既能保證與傳統(tǒng)湯劑一樣隨證加減，還可規(guī)避后者攜帶不便、煎煮麻煩等缺點，在一定程度上推動了劑型改革創(chuàng)新的進程，但市售品質(zhì)量良莠不齊，故加強其質(zhì)量控制非常重要[6]。國家藥典委員會于2016年發(fā)布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求(征求意見稿)》，指出中藥配方顆粒應(yīng)以標準湯劑為與臨床湯劑療效基本一致的標準參照物，并明確以出膏率、指標成分的含量及轉(zhuǎn)移率、特征圖譜等指標為表征，從而進一步衡量兩者一致性[7-10]。因此，本實驗基于標準湯劑對槲寄生配方顆粒質(zhì)量標準進行研究，以期為探討其代替?zhèn)鹘y(tǒng)湯劑的可行性和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；TS8606凍干機(德國Fevik公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CP225D電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 紫丁香苷對照品(批號111574-201605，中國食品藥品檢定研究院，純度95.2%)。槲寄生配方顆粒(每1 g相當于3.5 g藥材，批號210601、210602、210603，由藥材S5標準湯劑制備，山東宏濟堂制藥集團股份有限公司)。15批藥材具體信息見表1，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學徐凌川教授鑒定為桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥帶葉莖枝，根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》(征求意見稿)要求結(jié)合現(xiàn)代臨床用藥習慣制備標準湯劑，方法為取各批藥材100 g，煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后改為文火煎煮1 h；第2次加8倍量水，武火煮沸后改為文火煎煮40 min，趁熱過濾，合并2次濾液，即得，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥制成凍干粉。甲醇為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸為色譜純(美國Fisher Scientific公司)；甲醇為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)；水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 紫丁香苷含量測定

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 對照品溶液 精密稱取紫丁香苷對照品適量，甲醇制成25 μg/mL溶液，即得。

2.1.1.2 供試品溶液 取配方顆粒、標準湯劑凍干粉適量，研細，取粉末約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL70%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得配方顆粒、標準湯劑供試品溶液；取藥材約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻，50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得藥材供試品溶液。

2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Waters Atlantis T3色譜柱，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相甲醇-0.1%磷酸(12∶88，40 min)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長264 nm。精密吸取對照品、供試品溶液各1 μL，在上述色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1，理論塔板數(shù)按紫丁香苷峰計，應(yīng)不低于5 000。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取紫丁香苷對照品10.97 mg，甲醇定容至200 mL，依次稀釋2、4、8、16倍，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=6.148 1X-0.052 7(r=1.000 0)，在3.26～52.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 重復性試驗 取配方顆粒6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，測得紫丁香苷峰面積RSD為1.06%，表明該方法重復性良好；

2.1.4.2 中間精密度試驗 不同分析人員在不同時間點進行試驗，測得紫丁香苷含量RSD為1.05%，同時不同儀器測得配方顆粒中該成分含量RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得紫丁香苷峰面積RSD為1.35%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.4 加樣回收率試驗 取6份配方顆粒粉末，每份約0.15 g，精密稱定，加入對照品溶液適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，紫丁香苷平均加樣回收率為96.69%，RSD為3.75%。

2.1.4.5 耐用性試驗 采用不同品牌型號的色譜柱測定同一份供試品溶液，測得紫丁香苷含量RSD為1.73%，表明該方法耐用性良好。

2.1.5 結(jié)果分析 取15批藥材、標準湯劑、配方顆粒，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，計算出膏率、含量、轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2，可知標準湯劑出膏率、轉(zhuǎn)移率較穩(wěn)定，而含量具有一定離散性，主要是由于藥材差異所致。由表2可知，出膏率平均值為22.18%，22.18%±30%為15.52%～28.83%。因此，采用含量最大值、最小值制定紫丁香苷含量限度，公式為含量上限=配方顆粒制成量×出膏率上限×最大指標含量，即3.5×28.83%×2.73 mg/g=2.75 mg/g；含量下限=配方顆粒制成量×出膏率下限×最小指標含量，即3.5×15.52%×1.15 mg/g=0.62 mg/g，考慮到不同批次藥材的差異性及大生產(chǎn)的復雜性，最終確定為0.6～3.0 mg/g。

表2 各樣品出膏率、含量、轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果

另外，3批配方顆粒中紫丁香苷含量符合相關(guān)要求；轉(zhuǎn)移率與標準湯劑(S5)接近，而且均在各標準湯劑變異可接受范圍內(nèi)，表明該制劑制備工藝較合理。

2.2 標準湯劑HPLC特征圖譜建立

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Waters Atlantis T3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～5 min，1%～2%B；5～41 min，2%～41%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長264 nm；進樣量3 μL。以紫丁香苷峰為參照峰(S)，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于5 000，色譜圖見圖2。

2.2.2 方法學考察

2.2.2.1 精密度試驗 取“2.1.1”項下同一份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得各共有峰峰面積RSD為0.54%～0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.2 重復性試驗 取同一批標準湯劑，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰峰面積RSD為0.44%～1.76%，表明該方法重復性良好。

2.2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.1”項下同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰峰面積RSD為0.17%～1.87%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 圖譜生成 取“2.1.1”項下供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，結(jié)果見圖3～4。以S1為參照，對15批藥材特征圖譜進行共有峰標識，并進行峰匹配，選擇出峰穩(wěn)定，峰形、分離度較好的6個共有峰作為特征峰(峰5為紫丁香苷)；15批標準湯劑特征圖譜以S1為參照，多點校正后對共有峰進行Mark匹配，并進行相似度分析，結(jié)果見表3，可知除S1外其他批次標準湯劑的相似度均大于0.9，具有良好的相似度。

表3 15批標準湯劑相似度

以5號峰(紫丁香苷)為參照(S)，測得各共有峰相對保留時間RSD為0～0.72%，但相對峰面積差異較大，見表4?？紤]到藥材在運輸、儲存等不同環(huán)節(jié)存在的其他因素，故不限定其特征圖譜的相對峰面積范圍。

2.2.4 聚類分析 將15批標準湯劑中各共有峰的峰面積進行量化處理，通過SPSS 20.0軟件進行聚類分析[11]，結(jié)果見圖5。由此可知，當刻度距離為20時，可分為2類，S2～S4、S6～S15聚為1類，S1、S5聚為1類，其中后兩者產(chǎn)地均為河南，并且紫丁香苷含量更高。

2.2.5 主成分分析 將15批標準湯劑中各共有峰的峰面積進行量化處理，通過SPSS 20.0軟件進行主成分分析[12-14]，以特征值>1為提取標準得到2個主成分，累積方差貢獻率為83.542%，可代表共有峰大部分信息，見圖6。圖7、表5顯示，S1、S5分布比較離散，與其他樣品差異較大，可能與紫丁香苷含量有關(guān)，與聚類分析結(jié)果一致。

表5 15批標準湯劑主成分分析得分系數(shù)矩陣

2.3 配方顆粒HPLC特征圖譜建立 在“2.2.1”項色譜條件下建立3批配方顆粒(210601，編號P1；210602，編號P2；210603，編號P3)、標準湯劑(S5)的HPLC特征圖譜，結(jié)果見圖8、表6～7。由此可知，3批配方顆粒特征圖譜均呈現(xiàn)與S5相同的6個共有峰，并且其相對保留時間、相對峰面積基本一致，均處于標準湯劑質(zhì)量標準規(guī)定范圍內(nèi)，符合要求；多點校正后進行共有峰Mark匹配，測得相似度分別為0.993、0.986、0.989，均大于0.98。

表6 3批配方顆粒、標準湯劑(S5)中共有峰相對保留時間

表7 3批配方顆粒、標準湯劑(S5)中共有峰相對峰面積

3 討論

紫丁香苷是槲寄生主要有效成分，專屬性較強[15-16]，故本實驗選擇該成分作為指標建立HPLC特征圖譜。

結(jié)果顯示，除S1外其他14批標準湯劑特征圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.9，表明各批次之間相似度較好，并且3批配方顆粒特征圖譜均呈現(xiàn)與S5標準湯劑相同的6個共有峰。再依據(jù)配方顆粒與標準湯劑相對保留時間、相對峰面積、特征圖譜相似度評價結(jié)果進行量值傳遞評價[17-18]，發(fā)現(xiàn)其特征圖譜量值得到穩(wěn)定傳遞，基本保證了配方顆粒與標準湯劑的一致性。

4 結(jié)論

本實驗以槲寄生標準湯劑出膏率、紫丁香苷含量及轉(zhuǎn)移率、特征圖譜為表征，衡量了槲寄生配方顆粒與標準湯劑的一致性，闡明了前者與藥材、標準湯劑在化學成分上的相關(guān)性，克服了依靠單一成分進行評價的缺點，能全面反映該制劑內(nèi)在質(zhì)量，為其替代傳統(tǒng)湯劑提供了研究基礎(chǔ)。