HPLC法同時(shí)測(cè)定木香順氣丸中6種成分

李靜華， 王麗瓊

(1.樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂(lè)山 614000；2.樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000；3.四川省藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 樂(lè)山 614000)

木香順氣丸功效行氣化濕、健脾和胃，方中厚樸、枳殼、陳皮、青皮為臣藥，甘草為使藥[1]，其中甘草指標(biāo)成分為甘草苷，健脾益氣，補(bǔ)中除濕[2-3]；陳皮、青皮、枳實(shí)指標(biāo)成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷[4-6]，行氣燥濕，散結(jié)消積；厚樸指標(biāo)成分為和厚樸酚、厚樸酚[7-8]，行氣燥濕，散結(jié)消積。該制劑收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部，但只測(cè)定了和厚樸酚、厚樸酚含量[9]，而中藥質(zhì)量和療效提倡整體性，故多組分同時(shí)測(cè)定可更全面地體現(xiàn)其質(zhì)量[10-12]。

前期孫全明[13]、曹瑞竹[14]等采用HPLC法測(cè)定木香順氣丸中木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、厚樸酚、和厚樸酚、甘草酸含量，王玲嬌等[15]采用光譜指紋法評(píng)價(jià)木香順氣丸質(zhì)量，但尚無(wú)同時(shí)測(cè)定甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚含量的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定該制劑中上述6種成分的含量，以期為整體全面地控制其質(zhì)量提供可靠科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；XS205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ULUP-II-10T優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司)。

厚樸酚(批號(hào)110729-201513，純度98.8%)、和厚樸酚(批號(hào)110730-201614，純度99.3%)、新橙皮苷(批號(hào)111857-201804，純度99.4%)、橙皮苷(批號(hào)110721-201818，純度96.2%)、柚皮苷(批號(hào)110722-201613，純度94.3%)、甘草苷(批號(hào)111610-201607，純度93.1%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。木香順氣丸(甘肅佛仁制藥科技有限公司，批號(hào)200401；山西萬(wàn)輝制藥有限公司，批號(hào)191101；甘肅河西制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)200901)，規(guī)格均為每袋6 g。乙腈、甲醇為色譜純(北京百靈威科技有限公司)；N-N二甲基甲酰胺為分析純(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；磷酸為分析純[重慶川東化工(集團(tuán))有限公司]；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品厚樸酚24.78 mg、和厚樸酚14.19 mg、新橙皮苷17.50 mg、橙皮苷120.62 mg、柚皮苷27.61 mg、甘草苷11.04 mg，分別置于6個(gè)25 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取5、5、10、10、10、2 mL，置于同一50 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，精密量取5 mL，置于10 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 將本品粉碎，取約1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入N-N二甲基甲酰胺50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，N-N二甲基甲酰胺補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方制得不含陳皮、青皮、枳殼、甘草、厚樸的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 SVEA C18Opal色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%磷酸(A)-乙腈(B)-甲醇(C)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.3 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在”2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖中各成分保留時(shí)間與對(duì)照品溶液色譜圖中一致，并且分離度符合要求，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下貯備液8、6、4、2、1 mL，分別置于5個(gè)10 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，再以S/N=10計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷峰面積RSD分別為0.4%，0.3%，0.7%，0.8%，1.1%、0.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品(批號(hào)200401)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷含量RSD分別為1.2%，1.3%，1.6%，1.6%，1.9%、1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào)200401)適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷峰面積RSD分別為0.9%、0.9%、1.2%、1.3%、1.4%、1.1%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品(批號(hào)200401，厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷含量分別為2.089 2、0.752 7、1.443 7、20.935 5、1.935 4、0.148 5 mg/g)6份，每份約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入 “2.1.1”項(xiàng)下0.2 mL甘草苷貯備液、1 mL柚皮苷貯備液、2 mL橙皮苷貯備液、1 mL新橙皮苷貯備液、0.7 mL和厚樸酚貯備液、1 mL厚樸酚貯備液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各6份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷平均加樣回收率分別為101.0% (RSD=2.0%)、100.7% (RSD=1.5%)、100.1% (RSD =1.4%)、99.8% (RSD =1.7%)、100.6% (RSD =1.9%)、99.1%(RSD=1.9%)。

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行3份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘草苷在276 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，而且吸收強(qiáng)度較大，同時(shí)厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷在該處的吸收強(qiáng)度也較好。最終確定，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。

3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、甲醇對(duì)各成分分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)采用乙腈時(shí)色譜峰保留時(shí)間提前，峰形尖銳，并且加入一定比例甲醇后保留時(shí)間適中，分離度良好。由于各成分理化性質(zhì)不一致，故前10 min進(jìn)行大比例水相等度洗脫，10～17 min進(jìn)行梯度洗脫，可將柚皮苷、橙皮苷與相鄰雜質(zhì)峰的分離度提高到3.0左右，從而排除干擾峰的影響。

3.3 提取溶劑選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了50%甲醇、2%醋酸甲醇、甲醇、N-N二甲基甲酰胺、甲醇-(N-N二甲基甲酰胺)混合溶液(比例分別為45∶5、40∶10、30∶20、20∶30、10∶40、5∶45)對(duì)各成分提取能力的影響，發(fā)現(xiàn)甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷提取率受溶劑種類的影響較大，尤其是含量較高的橙皮苷；以N-N二甲基甲酰胺提取時(shí)，各成分溶解性較好，提取完全。最終確定，提取溶劑為N-N二甲基甲酰胺。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定木香順氣丸中厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷的含量，該方法操作簡(jiǎn)單，方法學(xué)考察結(jié)果良好，可為整體全面地控制該制劑質(zhì)量提供可靠科學(xué)的依據(jù)。