一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定連翹歸尾顆粒中3種成分

遆安航， 李思思， 陳 瑾， 翟康欣， 譚麗媛， 張淑蓉

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030600)

連翹歸尾煎出自《景岳全書(shū)》，由連翹、歸尾、甘草、金銀花、紅藤組成，功效清熱解毒、活血消腫[1]，可治療乳癰、口疽、頰瘍、牙癰、豬丹毒等[2]，方中連翹、金銀花為君藥，具有清熱解毒、散結(jié)消腫作用[3]。課題組前期發(fā)現(xiàn)，該方在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均顯示對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，為了更有效地開(kāi)展后期研究，保證實(shí)驗(yàn)樣本前后的一致性，已將其改制成顆粒劑[4]。

為了降低檢測(cè)成本，同時(shí)結(jié)合中藥中多種成分相互作用、復(fù)雜多變等特點(diǎn)[5]，采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定多指標(biāo)成分含量已成為發(fā)展趨勢(shì)和研究熱點(diǎn)[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立該方法同時(shí)測(cè)定連翹歸尾顆粒中連翹酯苷A、綠原酸、連翹苷的含量[7]，以期為該制劑質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 數(shù)顯電熱套購(gòu)自金壇市杰瑞爾電器有限公司(型號(hào)HDM500-10450)；中藥材粉碎機(jī)購(gòu)自廣州真麥機(jī)械設(shè)備有限公司(型號(hào)LG-50)；恒溫水浴鍋購(gòu)自上海比朗儀器制造有限公司(型號(hào)HH-2)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自鞏義市英峪弘源儀器廠(型號(hào)RE-5205)；超聲波清洗機(jī)購(gòu)自杭州法蘭特超聲波科技有限公司(型號(hào)SB-5200 DTDN)；高效液相色譜儀購(gòu)自杭州瑞析科技有限公司(型號(hào)Waters e2695)、上海諾析儀器有限公司(型號(hào)Agilent 1260)；電動(dòng)噴霧器購(gòu)自武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司(型號(hào)CS-1020E)；電子天平(十萬(wàn)分之一)購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多公司(型號(hào)AE240)。

1.2 試劑與藥物 連翹歸尾顆粒(批號(hào)201020、201121、201222)及各陰性顆粒均為自制。綠原酸(批號(hào)110753-201716，純度>98%)、連翹酯苷A(批號(hào)111810-201606，純度>98%)、連翹苷(批號(hào)110821-200610，純度>98%)對(duì)照品及連翹(批號(hào)120908-201216)、金銀花(批號(hào)121060-201608)、甘草(批號(hào)120904-201605)、大血藤(批號(hào)121353-201704)對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(河南薩默生物科技有限公司)；甲酸、甲醇為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Scientific BDS HYPERSIL C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～6 min，5%～9%A；6～9 min，9%～12%A；9～22 min，12%～14%A；22～35 min，14%～24%A；35～40 min，24%～26%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱(chēng)取本品粉末(過(guò)6號(hào)篩)2 g，置于具塞錐形瓶中，加20%乙醇10 mL，密塞，浸泡40 min，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(功率250 W、頻率45 kHz)處理45 min，放冷，20%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得(三者質(zhì)量濃度分別為0.538、0.066、0.222 mg/mL)，在4 ℃下保存。

2.2.3 陰性樣品溶液 將缺連翹、缺金銀花和大血藤陰性樣品研成粉末，過(guò)6號(hào)篩，分別精密稱(chēng)取2 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專(zhuān)屬性考察 取“2.2”項(xiàng)下供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分色譜峰均能達(dá)到基線分離，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液4、8、16、24、32、40 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程分別為連翹酯苷AY=888 061X-51 410(r=0.999 9)，線性范圍1.08～10.76 μg/mL；連翹苷Y=747 692X-3 710(r=1.000 0)，線性范圍0.13～1.32 μg/mL；綠原酸Y=1 798 549X-26 262(r=0.999 9)，線性范圍0.44～4.44 μg/mL，均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液16 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸峰面積RSD分別為0.16%、0.07%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 將同一批本品(批號(hào)201020)研成粉末，過(guò)6號(hào)篩，精密稱(chēng)取6份，每份2 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸含量RSD分別為2.88%、2.22%、2.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將本品(批號(hào)201020)研成粉末，過(guò)6號(hào)篩，精密稱(chēng)取2 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，每隔4 h取出，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸峰面積RSD分別為0.58%、1.03%、2.47%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 將各成分含量已知的本品(批號(hào)201020)研成粉末，過(guò)6號(hào)篩，精密稱(chēng)取1 g，置于錐形瓶中，精密加入適量對(duì)照品溶液，平行9份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率[8]，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5、10、15、20、30 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以連翹酯苷A為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他2種成分相對(duì)校正因子fk/s[9]，公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子

2.10 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 分別采用Agilent 1260型、Waters e2695型色譜儀，以及Thermo Scientific BDS HYPERSIL C18、Hypersil BDS C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，按“2.9”項(xiàng)下方法計(jì)算相對(duì)校正因子，平行6次，結(jié)果見(jiàn)表3，可知均無(wú)明顯影響(RSD<3%)。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.11 色譜峰定位 考察了“2.10”項(xiàng)下儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均無(wú)明顯影響(RSD<3%)。

表4 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響

2.12 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各平行3份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，2種方法所得結(jié)果接近[相對(duì)誤差(RE)<1%]，表明一測(cè)多評(píng)法可用于含量測(cè)定。

3 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，連翹酯苷A、連翹苷具有抗菌、抗衰老等作用[10-12]，綠原酸具有抗內(nèi)毒素、抗腫瘤等作用[13-14]，均與連翹歸尾煎功能主治相符。由于連翹酯苷A在HPLC色譜圖中的出峰位置位于綠原酸和連翹苷的中間，并且性質(zhì)較穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)以其為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.1%甲酸的分離效果，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%甲酸洗脫時(shí)各成分基線分離較好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

4 結(jié)論

目前，有關(guān)一測(cè)多評(píng)法的報(bào)道大多是測(cè)定同一味藥中同一種類(lèi)成分的含量[15-16]，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了連翹歸尾顆粒中不同種類(lèi)成分的含量，并且該方法具有專(zhuān)屬度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，可為該制劑質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。