熊果苷對(duì)膀胱癌EJ-1細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究

郭錦輝， 高衛(wèi)芳， 鄧智建

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南新鄉(xiāng) 453100）

膀胱癌在發(fā)生發(fā)展的任何階段均能夠在幾個(gè)月內(nèi)發(fā)生快速的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[1]。由于膀胱癌的高復(fù)發(fā)率，手術(shù)或者外部放射治療一直是治療的主要手段[2]，但其副作用較大[3，4]。目前，中藥提取物治療腫瘤成為研究熱點(diǎn)。熊果苷（氫醌-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）是從熊果的樹(shù)皮和葉子中提取的物質(zhì)[5]。研究表明，熊果苷可抑制哺乳動(dòng)物黑色素生成的限速酶酪氨酸酶[6]，被廣泛用于治療皮膚色素沉著異常癥狀（如黃褐斑和雀斑），也被用于生產(chǎn)部分皮膚美白化妝品[7，8]。且臨床已證實(shí)熊果苷在人體內(nèi)是安全的，沒(méi)有明顯的毒副作用[9]。既往有研究表明，熊果苷具有作為抗腫瘤劑的潛在作用，可有效抑制膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為[10]。為進(jìn)一步探討熊果苷在膀胱癌治療中的作用，我們從細(xì)胞周期調(diào)控角度觀察熊果苷對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ-1增殖的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞EJ-1獲自武漢大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)物中心。于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 藥物、試劑與儀器 熊果苷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和磷酸化ERK（p-ERK）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam生物公司；細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）、p21購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Western blot轉(zhuǎn)印儀、電泳凝膠圖像分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 MTT法測(cè)定EJ-1細(xì)胞增殖能力 將EJ-1細(xì)胞以2×106/孔接種在6孔板中培養(yǎng)24 h后分為6組，除對(duì)照組之外，其余各組分別加入10、20、50、100、500 μg/mL熊果苷處理24 h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液（用PBS配）20 μL。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度（D）值，記錄結(jié)果。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對(duì)照組D值-實(shí)驗(yàn)組D值）/對(duì)照組D值×100%。再以同樣方法，測(cè)定100 μg/mL熊果苷作用EJ-1細(xì)胞24、48、72、96 h的細(xì)胞增殖抑制率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 將EJ-1細(xì)胞以2×106/孔接種在6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入100 μg/mL熊果苷作用細(xì)胞24、48、72、96 h后，以胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸浮液；將細(xì)胞調(diào)至5×105～1×106個(gè)細(xì)胞/管，并重懸于2 mL冰磷酸鹽緩沖液（PBS）中。收集細(xì)胞使其在乙醇4℃孵育1h后，除去乙醇，PBS清洗3次。將200μL PBS和2 μL核糖核酸酶溶液（0.25 mg/mL）加入到每個(gè)試管中于室溫處理30 min。再加入0.5 mL 50 μg/mL的碘化丙啶溶液室溫避光染色30 min，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞周期變化。細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）按照下列公式計(jì)算：PI（%）=（S期+G2期/M期）/（G0期/G1期+S期+G2期/M期）。以亞G1峰比值分析細(xì)胞凋亡情況。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)ERK、p-ERK、Cyclin D1、p21蛋白的表達(dá) 將EJ-1細(xì)胞（2×105）在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h，用熊果苷（100 μg/mL）處理96 h。加入細(xì)胞裂解物及完整的蛋白酶抑制劑混合物提取蛋白。將樣品以12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，于含有0.5%Tween20的PBS中加入5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，孵育20 min后，稀釋度為 1∶1 000的一抗（ERK、p-ERK、Cyclin D1、p21）4℃孵育過(guò)夜，室溫充分沖洗后使用二抗孵育2 h，顯影，最后用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，組間比較采用Student t-檢驗(yàn)法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞增殖的影響 圖1結(jié)果顯示：不同質(zhì)量濃度（10、20、50、100、500 μg/mL）熊果苷作用 EJ-1細(xì)胞24 h后，50、100 μg/mL熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），其中100 μg/mL增殖抑制作用最強(qiáng)。故選取100 μg/mL的熊果苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

2.2 不同作用時(shí)間熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞增殖的影響 圖2結(jié)果顯示：以100 μg/mL熊果苷作用EJ-1細(xì)胞24、48、72、96 h后，以MTT法測(cè)定EJ-1細(xì)胞增殖能力。EJ-1細(xì)胞增殖抑制率分別為51.3%、71.9%、82.6%、92.8%。表明熊果苷以時(shí)間依賴性的方式抑制EJ-1細(xì)胞的增殖。

圖1 不同質(zhì)量濃度熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞增殖能力的影響Figure 1 The effect of different mass concentrations of arbutin on the proliferation capacity of EJ-1 cells(-x±s)

圖2 100 μg·mL-1熊果苷不同作用時(shí)間對(duì)EJ-1細(xì)胞增殖能力的影響Figure 2 The effect of arbutin at 100 μg·mL-1on the proliferation capacity of EJ-1 cells at different treatment time (-x±s)

2.3 熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)觀察熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。表1結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的進(jìn)展，EJ-1細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞百分比逐漸升高，G2/M期細(xì)胞百分比逐漸降低。熊果苷作用96 h的EJ-1細(xì)胞PI明顯降低，與處理24～48 h的細(xì)胞PI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明熊果苷可干擾EJ-1細(xì)胞的周期進(jìn)展，具有時(shí)間依賴性，將細(xì)胞阻滯于G2/M期。同時(shí)，隨著時(shí)間的進(jìn)展，亞G1峰值逐漸升高，96 h時(shí)最為明顯（P＜0.05）。表明熊果苷可促進(jìn)EJ-1細(xì)胞凋亡，且呈時(shí)間依賴性。

表1 不同作用時(shí)間熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞周期的影響Table 1 The effect of arbutin on the cell cycle of EJ-1 cells at different treatment time （-x±s，p/%）

2.4 熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21蛋白的影響 以100 μg/mL熊果苷作用EJ-1細(xì)胞0、24、48、72、96 h后，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21蛋白的表達(dá)水平。圖3、表2結(jié)果顯示：與同組0 h比較，作用24、48、72、96 h后，p-ERK蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），呈逐漸下降后再升高的趨勢(shì)。ERK蛋白表達(dá)水平均降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），呈逐漸升高后再下降的趨勢(shì)。p21蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，于96 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 EJ-1細(xì)胞p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21凝膠電泳圖Figure 3 The gel electrophoresis image of p-ERK，ERK，Cyclin D1，and p21 in EJ-1 cells

表2 不同作用時(shí)間熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21蛋白表達(dá)的影響Table 2 The effect of arbutin on the expression of p-ERK，ERK，Cyclin D1，and p21 of EJ-1 cells at different treatment time （-x±s，p）

3 討論

在亞洲，膀胱癌每年有15.3萬(wàn)的新發(fā)膀胱癌病例和3.5萬(wàn)人死亡；在我國(guó)，2015年新增膀胱癌患者人數(shù)估計(jì)為2.3萬(wàn)人，死亡人數(shù)估計(jì)為1.1萬(wàn)人[11，12]。膀胱癌可以分為非肌肉浸潤(rùn)性腫瘤和肌肉浸潤(rùn)性腫瘤2類[13]。盡管70%～80%的患者被診斷為非肌層浸潤(rùn)性腫瘤，但是在這些患者中觀察到明顯的高復(fù)發(fā)率（50%～70%），而在復(fù)發(fā)病例中，15%的膀胱癌患者發(fā)展為肌肉浸潤(rùn)性疾病[14，15]。非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的5年生存率接近90%，而肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的5年生存率約為60%[16]，近80%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者在頭5年內(nèi)死亡[17]。由于多數(shù)針對(duì)晚期膀胱癌的西醫(yī)治療的臨床試驗(yàn)效果有限，所以開(kāi)發(fā)更安全有效的治療藥物十分必要。

研究表明，熊果苷可以作為天然分子結(jié)合受體與miRNA結(jié)合并參與其表達(dá)調(diào)控過(guò)程，影響細(xì)胞自身的增殖和凋亡行為[18]。本研究結(jié)果顯示：100 μg/mL熊果苷對(duì)EJ-1細(xì)胞增殖的抑制作用最佳，且呈時(shí)間依賴性。100 μg/mL熊果苷作用96 h的EJ-1細(xì)胞PI下降，與處理24～48 h的細(xì)胞PI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。亞G1峰值逐漸升高，96 h時(shí)最為明顯（P＜0.05）。表明熊果苷可干擾EJ-1細(xì)胞的周期進(jìn)展，具有時(shí)間依賴性，可將細(xì)胞阻滯于G2/M期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

已知ERK蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用[19]，參與了細(xì)胞周期調(diào)控[20]。細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1是通過(guò)G1期的細(xì)胞周期進(jìn)展的限速和關(guān)鍵因子[21]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21也可以參與細(xì)胞周期調(diào)控[22]。p21的表達(dá)增加可能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和隨后的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制[23]。本研究結(jié)果顯示：與同組0 h比較，作用24、48、72、96 h后，p-ERK蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），呈逐漸下降后再升高的趨勢(shì)；ERK蛋白表達(dá)水平均降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），呈逐漸升高后再下降的趨勢(shì)；p21蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，于96 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明熊果苷處理膀胱癌EJ-1細(xì)胞后可抑制ERK蛋白的磷酸化進(jìn)程。由于ERK通路是主要的促有絲分裂信號(hào)，因此，熊果苷對(duì)ERK信號(hào)通路途徑的滅活似乎對(duì)其抗增殖作用有直接的干擾，其具體作用環(huán)節(jié)還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們研究了熊果苷對(duì)膀胱癌EJ-1細(xì)胞的抗增殖作用及相關(guān)機(jī)制，研究結(jié)果表明熊果苷可抑制膀胱癌EJ-1細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白ERK和p21蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究拓展了中藥提取物熊果苷的應(yīng)用價(jià)值，也為臨床應(yīng)用熊果苷治療膀胱癌奠定了基礎(chǔ)。