糖尿病視網(wǎng)膜病變生物標志物的表達與測定

蔣依琳 綜述 張曉敏 李筱榮 審校

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點實驗室 天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，天津 300384

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的血管并發(fā)癥，也是常見的致盲眼病之一。調(diào)查顯示，2013年我國DR患者人數(shù)已超過1億，成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。一般認為，糖尿病患者體內(nèi)長期持續(xù)的高血糖環(huán)境是觸發(fā)血管功能障礙的關(guān)鍵因素，而炎癥介質(zhì)的出現(xiàn)和血管生成相關(guān)因子間平衡的破壞可進一步推動疾病的發(fā)展，最終導(dǎo)致糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)和增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。由于DR在病變前期存在一定隱匿性，導(dǎo)致很多患者就醫(yī)時病情已到中晚期，視力受到不可逆損害，治療預(yù)后情況并不理想，因此，實現(xiàn)DR的早期診斷及治療具有重要的臨床意義。生物標志物主要指可以客觀測定和評價生物普遍生理、病理過程或治療反應(yīng)的某種特征性指標，通過對其測定可以獲知機體當前所處生物學(xué)過程的方向與進程。隨著生物標志物相關(guān)研究的快速發(fā)展，其在疾病的風(fēng)險評估、早期診斷及治療等方面發(fā)揮了重要作用。近年來，隨著生物組學(xué)和人工智能(artificial intelligence，AI)的發(fā)展，DR發(fā)生和發(fā)展中生物標志物的研究日新月異。本文就DR發(fā)生與發(fā)展中相關(guān)生物標志物表達和測定方法進行綜述，為更加有效地控制其發(fā)生和發(fā)展提供新思路。

1 血液及眼部組織中DR生物標志物的表達

1.1 糖化血紅蛋白

DR的發(fā)生和發(fā)展與血糖控制情況密切相關(guān)。糖化血紅蛋白(Hemoglobin A1c，HbA1c)是紅細胞中的血紅蛋白與血清中的糖類相結(jié)合的產(chǎn)物，可有效反映血糖控制水平，是糖尿病經(jīng)典的生物標志物。Lind等[2]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者患病前2～3年的HbA1c水平與當前DR進展的相對危險度關(guān)系最為密切。Nordwall等[3]對1型糖尿病患者隨訪20余年發(fā)現(xiàn)，HbA1c水平控制在<7.6%可有效預(yù)防DR。然而有研究表明，僅有11%的DR與HbA1c有關(guān)[4]。因此，HbA1c并非判斷DR發(fā)展的理想生物標志物。

1.2 炎癥類生物標志物

1964年，Powell等[5]發(fā)現(xiàn)，患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的糖尿病患者接受高劑量水楊酸鹽類藥物治療后，DR發(fā)病率遠低于預(yù)期，這一發(fā)現(xiàn)首次顯示炎癥與DR的發(fā)展相關(guān)。自此，研究人員陸續(xù)在DR患者的玻璃體、視網(wǎng)膜、淚液和血液等樣本中發(fā)現(xiàn)諸多炎癥相關(guān)因子表達異常。炎癥可能是引起DR一系列復(fù)雜病理過程的刺激因素和各種致病機制發(fā)揮作用的共同途徑[6]。

EURODIAB前瞻性并發(fā)癥研究結(jié)果顯示，C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子水平與1型糖尿病中微血管并發(fā)癥和心血管疾病密切相關(guān)[7]。江志堅等[8]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血清S100A8/A9質(zhì)量濃度與血清超敏C反應(yīng)蛋白質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其可能參與糖尿病微血管病變的發(fā)生和發(fā)展。Costagliola等[9]研究發(fā)現(xiàn)，淚液中TNF-α水平與DR嚴重程度高度相關(guān)。TNF-α可促進白細胞與血管內(nèi)皮細胞的不可逆黏附，增加內(nèi)皮細胞通透性，參與血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，可作為PDR發(fā)病的預(yù)測因子[10]。另有一些研究發(fā)現(xiàn)，DR患者房水、玻璃體及血漿中IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17及IL-37水平升高，其在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞凋亡、DME、血-視網(wǎng)膜屏障破壞、視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡和視網(wǎng)膜血管生成過程中均發(fā)揮一定作用，促進DR的進展[11-13]。

此外，Geng等[14]對中國糖尿病患者進行研究發(fā)現(xiàn)，甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)引發(fā)的炎癥及補體活化可能與糖尿病的血管并發(fā)癥有關(guān)，DR患者較糖尿病非視網(wǎng)膜病變患者血清MBL水平明顯升高，推測血清中MBL含量可作為中國人群DR的生物標志物。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可通過介導(dǎo)促炎細胞因子的產(chǎn)生從而激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙[15]。有研究表明，糖尿病患者和糖尿病動物模型的血清、玻璃體及視網(wǎng)膜中Hcy均顯著升高，Hcy有望成為DR的篩查和診斷指標，提高Hcy清除率可靶向預(yù)防及治療DR[16]。

1.3 血管生成類生物標志物

視網(wǎng)膜新生血管的出現(xiàn)預(yù)示著DR由非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)發(fā)展為PDR。及早監(jiān)測引起新生血管生成的因素并盡早控制可有效延緩PDR的進展，保護患者視力。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(主要是VEGF-A)是控制血管生成的主要因子，無DR的糖尿病患者眼部VEGF水平較低，而DR患者玻璃體及淚液中VEGF水平升高且與DR嚴重程度呈正相關(guān)[17-18]?？筕EGF治療是目前臨床治療DR的主要手段。然而，DR臨床研究顯示，僅抑制VEGF不足以完全阻止視網(wǎng)膜新生血管形成，這提示其他因子也參與這一過程[19]。促紅細胞生成素是一種糖蛋白激素，對血管內(nèi)皮細胞具有調(diào)節(jié)作用，是一種強效的缺血誘導(dǎo)血管生成因子，在PDR視網(wǎng)膜新生血管生成過程中獨立于VEGF發(fā)揮作用[20]。此外，低氧誘導(dǎo)因子1、血小板源性生長因子B、胎盤生長因子、血管生成素2等均在DR患者玻璃體及視網(wǎng)膜組織中表達升高，參與新生血管形成[21]。

正常生理狀態(tài)下，組織內(nèi)的促血管生成因子和抗血管生成因子之間保持穩(wěn)態(tài)平衡，共同維持血管的健康狀態(tài)。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是最有效的天然抗血管生成因子[22]。多項研究表明，DR患者尤其是PDR患者房水和玻璃體液中PEDF水平降低[23-25]。房水和玻璃體液PEDF濃度變化可能在DR進展中具有一定預(yù)測價值。

1.4 DR生物標志物在組學(xué)分析中的表達與測定

隨著測序技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)和生物信息學(xué)等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實現(xiàn)了基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的快速高通量分析，這為了解疾病進程和發(fā)現(xiàn)生物標志物提供了極大便利。

1.4.1基因組學(xué)類生物標志物 研究表明，DR是一種多基因相關(guān)性疾病，存在明顯的家族聚集性，且其易感性與等位基因變異相關(guān)[26-27]?；蚪M學(xué)有助于揭示遺傳因素對DR的影響，為DR生物標志物的研究提供了新方向。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)通過在整個基因組中篩選單核苷酸多態(tài)性來識別與復(fù)雜疾病相關(guān)的數(shù)百種遺傳變異。GWAS已被用于多個人群以識別DR相關(guān)風(fēng)險基因[28-30]。其中，GRB2基因附近的遺傳變異已被發(fā)現(xiàn)與DR存在顯著相關(guān)性，且該變異為首個在多個研究隊列中可重復(fù)的研究成果[31]。下一代測序技術(shù)可對候選基因、全外顯子組或全基因組DNA中的每個核苷酸進行測定，其中，全外顯子組測序可有效幫助解釋遺傳學(xué)在DR中的作用。目前，共2項DR相關(guān)全外顯子組測序研究。Shtir等[32]以糖尿病史達10年但未出現(xiàn)DR者為試驗組、以DR患者為對照組進行研究，發(fā)現(xiàn)NME3、LOC728699、FASTK基因罕見變異可在一定程度上阻止DR出現(xiàn)。Ung等[33]采用類似的研究方法對DR發(fā)病機制進行探索，發(fā)現(xiàn)高血糖環(huán)境對VEGFB、VPS13B、PHF21A、NAT1、ZNF600、PKHD1L1表達的抑制在DR發(fā)展中起重要作用。哈佛大學(xué)喬斯林糖尿病中心與新墨西哥醫(yī)學(xué)院聯(lián)合開展了DR遺傳學(xué)研究，利用全外顯子組測序技術(shù)對DR進行炎癥和血管生成途徑相關(guān)基因和變異的全面基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)KLF17、ZNF395、CD33、PLEKHF5、COL18A1參與DR進展，NKX2.3則起保護性作用[34]。

1.4.2微小RNA類生物標志物 微小RNA(microRNA，miRNA)為非編碼RNA，可通過與mRNA結(jié)合控制轉(zhuǎn)錄后基因表達，促進mRNA降解和抑制蛋白翻譯。研究表明，miRNA參與DR視網(wǎng)膜新生血管形成和炎癥反應(yīng)[35-36]。Helal等[37]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-146a和miR-21的表達量與DR嚴重程度呈正相關(guān)，miR-34表達量則隨DR進展而降低，三者可成為DR診斷和預(yù)后的生物標志物。Liang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，與2型糖尿病無DR患者相比，DR患者血清中l(wèi)et-7a-5p、miR-novel-chr5_15976及miR-28-3p均顯著上調(diào)。Chen等[39]利用測序技術(shù)鑒定房水樣本發(fā)現(xiàn)，與無DR糖尿病患者相比，PDR患者房水miR-150-5P及miR-93-5p含量顯著降低，二者有望成為PDR生物標志物。Mazzeo等[40]分離健康者、無DR糖尿病患者和DR患者血漿細胞外囊泡，利用流式細胞儀和微陣列分析技術(shù)測定其內(nèi)miRNA含量，發(fā)現(xiàn)DR患者miR-150-5p含量顯著降低，miR-21-3p及miR-30b-5p含量顯著升高，三者可作為DR潛在生物標志物。目前已鑒定出miR-126、miR-3197及miR2116-5p等多種miRNA含量在DR進程中發(fā)生顯著變化并可作為DR生物標志物[41-42]。了解miRNA在DR中的作用有助于開發(fā)靶向調(diào)節(jié)miRNA的疾病治療新策略。

1.4.3蛋白質(zhì)組學(xué)類生物標志物 蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展讓我們能夠在更短的時間內(nèi)識別和分析更多蛋白質(zhì)、揭示蛋白質(zhì)功能和相互作用規(guī)律，有助于疾病診斷生物標志物和治療靶標的探索。目前，通過高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對淚液、房水、玻璃體、視網(wǎng)膜及血液等樣本進行分析，已發(fā)現(xiàn)多個在DR患者與無DR的糖尿病患者間有重要意義的差異蛋白。其中載脂蛋白和晶狀體蛋白等已成為診斷DR的潛在生物標志物，視黃酸受體反應(yīng)蛋白2、軸突生長導(dǎo)向因子4B、載脂蛋白B、熱休克蛋白70等有望成為PDR防治的新靶點[43]。

1.4.4代謝組學(xué)類生物標志物 代謝組學(xué)是新興的組學(xué)領(lǐng)域，可檢測體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等全部內(nèi)源性代謝物的整體動態(tài)變化，是基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的補充，有助于更好地識別生物標志物、了解疾病進程和探索新的藥物靶點[44]。血漿代謝組學(xué)可揭示DR進展代謝譜[45]。Barba等[46]發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體中乳酸和葡萄糖含量較高，而半乳糖醇和抗壞血酸含量顯著降低。Paris等[47]揭示了PDR患者玻璃體氨基酸、?；鈮A、嘌呤代謝受到嚴重損害的代謝特征，PDR患者和氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型玻璃體樣本均顯示精氨酸-脯氨酸通路活性增強，且該通路可作為DR治療靶點。Haines等[48]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者玻璃體黃嘌呤水平降低，氧化反應(yīng)產(chǎn)生的肌苷、次黃嘌呤、尿酸鹽、尿囊酸鹽水平升高。Chen等[49]利用血漿樣本首次發(fā)現(xiàn)DR患者2-脫氧核糖酸和3,4-二羥基丁酸水平升高，且二者可作為DR生物標志物，同時強調(diào)磷酸戊糖途徑代謝失調(diào)與DR密切相關(guān)。Rhee等[50]發(fā)現(xiàn)，與無DR的糖尿病患者相比，DR患者血漿谷氨酰胺含量升高、谷氨酸含量降低，二者及其比值可作為DR生物標志物。Sumarriva等[51]發(fā)現(xiàn)，相比于NPDR患者，PDR患者血漿脂肪酸代謝發(fā)生明顯改變。

2 DR生物標志物在影像分析中的表達與測定

2.1 影像學(xué)生物標志物

影像學(xué)技術(shù)的不斷革新推動著DR生物標志物由有創(chuàng)向無創(chuàng)的方向發(fā)展。近年來眼科影像學(xué)一些特征性指標已經(jīng)被納入到廣義的生物標志物范疇。

Ribeiro等[52]提出應(yīng)用軟件分析視網(wǎng)膜的微動脈瘤(microaneurysm,MA)周轉(zhuǎn)率，即微動脈瘤生成和消失的速率，預(yù)測NPDR患者發(fā)展為DME的風(fēng)險，MA周轉(zhuǎn)率越高，患者進展為DME的可能性越大。Pappuru等[53]的研究結(jié)果也強調(diào)了MA周轉(zhuǎn)率在識別DR進展中的重要作用。Santos等[54]將譜域光相干斷層掃描(spectral domain optical coherence tomography,SD-OCT)與多焦視網(wǎng)膜電圖聯(lián)合應(yīng)用以評估視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能，SD-OCT顯示的黃斑神經(jīng)節(jié)細胞層-內(nèi)叢狀層、視盤周圍神經(jīng)纖維層變薄以及多焦視網(wǎng)膜電圖提示的P1振幅下降、P1潛伏時間延長均出現(xiàn)在DR早期，甚至早于糖尿病患者出現(xiàn)明顯眼底異常，二者結(jié)合可用于糖尿病患者DR篩查及早期診斷。OCT血管成像可較早發(fā)現(xiàn)黃斑中心凹無血管區(qū)(foveal avascular zone,FAZ)面積擴大、脈絡(luò)膜新生血管早期征象等DR發(fā)生和發(fā)展標志，可用于DR篩查以及抗VEGF治療后的動態(tài)觀察[55]。

2.2 AI在生物標志物診斷分析中的應(yīng)用

近年來，隨著計算機數(shù)據(jù)分析能力的革新、算法研究的進展以及互聯(lián)網(wǎng)大數(shù)據(jù)平臺的普及，AI成為醫(yī)學(xué)輔助診斷領(lǐng)域的研究熱點。眼科AI技術(shù)將基于影像學(xué)資料建立的數(shù)據(jù)庫與深度學(xué)習(xí)(deep learning，DL)算法結(jié)合，可對FAZ面積、血管、MA等眼部特征性生物學(xué)結(jié)構(gòu)進行自動定量測量和分析[56]，快速篩選和捕捉異常的生物標志物并對疾病進行輔助診斷。Gulshan等[57]建立了由12.8萬幅彩色眼底像組成的大數(shù)據(jù)集訓(xùn)練DL算法，用于檢測DR，結(jié)果顯示，該系統(tǒng)敏感性和特異性分別達97.5%和96.1%，診斷準確度與眼科專家持平。Li等[58]利用DL算法和彩色眼底照片開發(fā)的自動評分系統(tǒng)，可用于檢測威脅視力的DR，其敏感性和特異性分別達97%和91.4%。Ting等[59]構(gòu)建了新加坡、中國、美國、墨西哥等6個國家正常人及不同程度DR患者的眼底照片數(shù)據(jù)集，評估DL系統(tǒng)的DR診斷性能，結(jié)果顯示，DL系統(tǒng)的敏感性和特異性分別為90.5%和91.6%。隨著DR篩查系統(tǒng)的不斷發(fā)展，AI的應(yīng)用有望結(jié)合影像學(xué)標志物以外更多的生物標志物資料、節(jié)約社會成本、提高DR早期篩查效率。

3 總結(jié)與展望

近年，DR相關(guān)生物標志物的研究發(fā)展迅猛，一部分證據(jù)較充分的標志物如HbA1c、VEGF等和一些無創(chuàng)的影像類指標等均已應(yīng)用于臨床，并在DR的風(fēng)險評估、盡早發(fā)現(xiàn)、進展預(yù)防、治療干預(yù)等方面發(fā)揮了不可代替的作用。但很多DR生物標志物還處在研究階段，有待進行更深入的了解。

理想的DR生物標志物應(yīng)該具備創(chuàng)傷小、便捷、經(jīng)濟、特異性高和可重復(fù)性強等特點。目前，DR發(fā)生與發(fā)展中相關(guān)生物標志物的研究仍面臨著樣本量需求大、需在不同人群中進行驗證、缺乏統(tǒng)一量化標準以及分析技術(shù)耗時長、成本高等難題。未來，隨著醫(yī)學(xué)與技術(shù)的不斷發(fā)展和科研工作者的不懈努力，將會有更多的理想生物標志物更廣泛應(yīng)用于臨床，實現(xiàn)DR早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，從而降低DR的致盲率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突