正交試驗(yàn)優(yōu)選補(bǔ)血養(yǎng)元合劑提取工藝

陳艷熙，陳安利，馬 卓

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068)

月經(jīng)問題對年輕女性生活、工作及健康有很大的影響[1]。經(jīng)期常伴有多種癥狀，如輕度抽筋、力竭等，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致不孕[2-4]。中藥因其多靶點(diǎn)、副作用少等優(yōu)勢，深受女性患者的喜愛，而月經(jīng)不調(diào)等癥狀多與氣血不足，陰虛等有關(guān)，故可選擇補(bǔ)腎益氣的藥方進(jìn)行調(diào)理[5]。補(bǔ)血養(yǎng)元合劑由淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等組成。其中，淫羊藿、黃芪屬君藥，起補(bǔ)氣升陽功效；月季花等為臣藥，起活血調(diào)經(jīng)功效；山茱萸等為佐藥，起補(bǔ)腎養(yǎng)陰功效；香附等為使，起疏肝行氣功效。使合劑具有補(bǔ)腎益氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)及治療陰陽平衡失調(diào)所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)和不孕癥的功效，適應(yīng)于各種貧血、證屬氣血虧虛者[6]。

本實(shí)驗(yàn)為考察不同提取因素對補(bǔ)血養(yǎng)元合劑質(zhì)量的影響，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)選出合劑的最佳水提工藝，為合劑的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等中藥材購自湖北強(qiáng)康中藥飲片公司，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2020版一部該藥材項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。

淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定研究院，純度98.9%，供含量測定用)。乙腈、甲醇為色譜純，甲酸為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，賽默飛U3000高效液相色譜儀(匠析生物科技有限公司)，H1650-W醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，ZFI-Ⅱ紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)，C21-SN216多功能電磁爐，實(shí)驗(yàn)室超純水器(武漢優(yōu)普純水設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材吸水率試驗(yàn)

為提高中藥飲片水提實(shí)驗(yàn)加水量的準(zhǔn)確度，確保飲片中有效成分的溶出度，提高補(bǔ)血養(yǎng)元合劑質(zhì)量，對中藥飲片的吸水量進(jìn)行考察。按處方比例準(zhǔn)確稱取淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等中藥飲片共3組，每組重315 g，分別用紗布包裹，加入10倍量水浸泡，常溫(25 ℃)放置，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、12 h時(shí)取出藥材，濾除多余水分，以無液體流出為標(biāo)準(zhǔn)，稱量濕飲片的重量記錄數(shù)值，按如下公式計(jì)算吸水率[7-8]，測定結(jié)果見表1。

表1 中藥飲片吸水率 %

由表1可知，3 h之后藥材的吸水率增加且緩慢達(dá)到飽和，測得飽和吸水率平均值為118.74%，因此首次提取時(shí)需多加1倍水。

2.2 淫羊藿苷含量測定[9-11]

2.2.1色譜條件采用十八烷基硅烷鍵合硅膠分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈(A)-0.2%甲酸(B)。流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長260 nm。梯度洗脫：0～20 min，20%A；20～30 min，20%～40%A；30～30.5 min，40%～20%A；30.5～33 min，20%A。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷對照品1.0 mg，加甲醇溶解，定容至100 mL容量瓶，搖勻，即得10 μg/mL對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取制備好的合劑1 mL，甲醇定容至100 mL，靜置一夜后，0.22 μm濾膜過濾。濾液即為供試品溶液。

2.2.4陰性對照溶液的制備按處方配比準(zhǔn)確稱取除淫羊藿以外的其他中藥飲片，處理方法同“2.2.3”。

2.2.5專屬性試驗(yàn)對上述對照品、供試品、陰性溶液進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示陰性無干擾，說明方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜

2.2.6線性關(guān)系考察精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL對照品溶液，用甲醇定容稀釋成2、4、8、16、32 μg/mL，依次進(jìn)行色譜分析。以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行回歸(圖2)，得回歸方程：y=0.2798x-0.0617(R2=0.9999)，說明淫羊藿苷在2～32 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。

圖2 淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn)重復(fù)取6次對照品溶液，每次20 μL進(jìn)行色譜分析。測得淫羊藿苷峰面積RSD為 0.294%，表明儀器精密度良好。

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按處方稱取飲片6份，平行制備6份供試品溶液進(jìn)行色譜分析。測得淫羊藿苷峰面積RSD為 1.24%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別在0、2、4、6、8、10、24 h取同一供試品溶液20 μL進(jìn)行色譜分析。測得淫羊藿苷峰面積RSD為1.73%，說明淫羊藿苷在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)取9份供試品溶液(每份含9.359 μg淫羊藿苷)，分為3組，各組分別加入淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品高中低劑量，用甲醇定容后進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)測得淫羊藿苷平均加樣回收率為99.97%，RSD為1.09%，說明該含量測定方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 干膏得率測定

取制備好的合劑300 mL，置于干燥至恒重的坩堝中，水浴蒸干，再于烘箱中105℃干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，精密稱定其質(zhì)量。

干膏得率=干膏質(zhì)量/原藥材質(zhì)量×100%

2.4 單因素考察實(shí)驗(yàn)

2.4.1加水倍數(shù)按處方配比精密稱取中藥飲片，分別加4、6、8、10、12倍水，提取2次，每次1 h，合并2次煎煮液并濃縮，得到提取液。由圖3可知，隨水倍數(shù)增加，淫羊藿苷含量和干膏得率呈先增加后下降趨勢。究其原因，可能是當(dāng)加水量過少，飲片未能浸泡完全，有效成分及其他物質(zhì)溶出率低；當(dāng)加水量過多，飲片中除淫羊藿苷外的其他物質(zhì)也充分溶出，物質(zhì)間可能發(fā)生了相互作用。當(dāng)加入8倍水時(shí)，淫羊藿苷含量和干膏得率達(dá)到最大值，故選擇6倍、8倍、10倍水為后續(xù)優(yōu)化參考水平。

圖3 加水倍數(shù)

2.4.2提取時(shí)間按處方配比精密稱取中藥飲片5份，分別提取30、60、90、120、150 min，均加入8倍水，提取2次，合并2次煎煮液并濃縮，得到提取液。由圖4可知，隨著提取時(shí)間延長，淫羊藿苷含量和干膏得率呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，可能是提取時(shí)間太短使得飲片中溶出的成分過少，而長時(shí)間提取則會使溶出的成分被破壞。淫羊藿苷含量和干膏得率在提取1h時(shí)達(dá)到最大值，故選擇0.5、1、1.5為后續(xù)優(yōu)化參考水平。

圖4 浸提時(shí)間

2.4.3提取次數(shù)按處方配比精密稱取中藥飲片3份，依次提取1、2、3次，均加8倍水，每次提取1 h，然后將煎液過濾并濃縮，得到提取液。由圖5可知，淫羊藿苷含量和干膏得率在提取2次后達(dá)到最大值，可能原因是提取次數(shù)過少，飲片成分不能充分溶出，而提取次數(shù)過多，則溶出的成份被破壞或成分之間發(fā)生相互作用使其含量降低。故選擇提取次數(shù)為1次、2次、3次為后續(xù)優(yōu)化參考水平。

圖5 浸提次數(shù)

2.5 水提正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表見表3。測定淫羊藿苷含量(a)和干膏得率(b)進(jìn)行綜合評分(Y)，其中淫羊藿苷含量占評分70%，干膏得率占評分30%。直觀結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表3 因素水平表

表4 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表

表5 方差分析結(jié)果

從表4中極值R可以看出，影響淫羊藿苷含量的3個(gè)因素次序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)>加水倍數(shù)>提取時(shí)間。與方差分析表所分析的“因素A和因素C對實(shí)驗(yàn)有顯著影響”結(jié)論相同。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到成本和提取時(shí)長，確定最佳提取工藝為A2B1C2，即8倍水提取2次，每次1 h。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按處方配比稱取中藥飲片3份，按優(yōu)化工藝A2B1C2(8倍水提取2次，每次1 h)做3次平行試驗(yàn)，測定干膏得率和淫羊藿苷含量。試驗(yàn)結(jié)果見表6，淫羊藿苷含量為27.55 μg/mL，干膏得率為36.26%。驗(yàn)證結(jié)果與正交結(jié)果相近，說明優(yōu)化的工藝條件具有可行性。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)束語

本研究采用正交法優(yōu)選補(bǔ)血養(yǎng)元合劑的提取工藝。結(jié)果表明，與常規(guī)提取條件所得結(jié)果相比，優(yōu)化工藝合劑中有效成分含量顯著提高，且最佳工藝條件為8倍水提取2次，每次1 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，本法具有可行性，且優(yōu)化工藝操作簡單、有可靠性，為制劑的大規(guī)模制備奠定了基礎(chǔ)。

本研究重在優(yōu)化補(bǔ)血養(yǎng)元合劑的提取工藝，提高有效成分的溶出度，若要保證臨床安全用藥，確定臨床用藥劑量，則還需進(jìn)行藥理學(xué)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。