植物發(fā)育相關(guān)miR319基因家族進(jìn)化及靶基因預(yù)測(cè)分析

薛巨坤，王 博，王蓮萍，楊春雨，國(guó)會(huì)艷，郝愛平

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 黑龍江 牡丹江 157011)

【研究意義】miRNA(microRNA)由美國(guó)科學(xué)家Lee在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，隨著功能研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA幾乎參與了生物體中各種重要的生理、生化過(guò)程,在調(diào)控基因表達(dá)方面起著關(guān)鍵的作用，此后miRNA得到廣泛的關(guān)注[1]。miRNA是一類長(zhǎng)度為19～24 nt的非編碼小分子RNA，其作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在真核生物的基因表達(dá)調(diào)控中有著非常重要的作用。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)與mRNAs的序列互補(bǔ)識(shí)別靶基因，并引起miRNA靶基因的降解或抑制其翻譯，最終達(dá)到抑制特定基因表達(dá)的目的[2]。植物生長(zhǎng)發(fā)育由一系列蛋白和植物激素決定，而這些蛋白的表達(dá)水平直接或間接受miRNA調(diào)控，縱觀近幾年研究成果，植物miRNA越來(lái)越受到研究者的青睞，特別是發(fā)現(xiàn)植物 miRNA可以進(jìn)入人體血液和組織器官以后，對(duì)植物 miRNA研究顯得尤為重要[3]。像其他信號(hào)分子一樣，植物miRNA也可以通過(guò)血管系統(tǒng)從一個(gè)組織移動(dòng)到另一個(gè)組織，這些移動(dòng)的miRNA可能在植物營(yíng)養(yǎng)平衡和應(yīng)對(duì)環(huán)境的生物和非生物脅迫具有重要作用[4]。植物中miRNA還具有很多功能，包括對(duì)器官與組織的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、在逆境的非生物脅迫中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用以及在干旱、寒冷、鹽漬化土壤、病蟲害等環(huán)境下進(jìn)行自我調(diào)控，使植物對(duì)惡劣環(huán)境下做出應(yīng)答[5]。此外miRNA在植物中所介導(dǎo)的RNA干擾方法可能有助于開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物，通過(guò)賦予生物(病原體)抗性以及非生物脅迫反應(yīng)更好地改善作物的品質(zhì)[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)，與植物發(fā)育及脅迫調(diào)控相關(guān)的miRNA包括miR156、miR164、miR169、miR396、miR398、miR319等，其中miR319是目前研究比較透徹的與植物發(fā)育相關(guān)miRNA代表之一。miR319與植物葉、花器官的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，并且參與調(diào)控部分植物激素載體蛋白，從而調(diào)控部分植物激素合成以及重要信號(hào)傳導(dǎo)通路[7]。TCP轉(zhuǎn)錄因子是miR319的靶基因，其基因家族的命名是來(lái)自最初確定的不同植物的4個(gè)基因：金魚草中的CYC(CYCLO-IDEA)基因，玉米中的TB1(TEOSINTE BRANCHED 1)基因，水稻中的PCF1和PCF2基因[8]。有研究表明過(guò)表達(dá)miR319番茄植株生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，葉片的表皮毛密度顯著増大，花器官變小且花粉飽滿度下降[9]。在大白菜中，球形為柱形的大白菜與低水平表達(dá)BrpTCP4-1有關(guān)，球形為圓形的大白菜與高水平BrpTCP4-1有關(guān)，而miR319通過(guò)控制BrpTCP4-1基因表達(dá)水平來(lái)控制大頭菜頭部形狀[10]。在擬南芥中，TCP4可以通過(guò)控制miR396、ICK1來(lái)激活或抑制細(xì)胞增殖，當(dāng)TCP4水平增加時(shí)會(huì)使擬南芥葉片變小，而miR319會(huì)直接定量控制TCP4從而調(diào)節(jié)植物葉片的大小[11]。還有研究表明：miR319通過(guò)調(diào)控?cái)M南芥光形態(tài)建成過(guò)程中的負(fù)調(diào)控因子TCP的表達(dá)影響其下胚軸的發(fā)育。TCP2、TCP3、TCP4、TCP10和TCP24是miR319的靶基因，異位表達(dá)的TCP2、TCP3、TCP4和過(guò)表達(dá)的miR319會(huì)導(dǎo)致擬南芥的表型變?yōu)檩p度光敏感型，因此miR319是擬南芥下胚軸生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑[12]。此外，miR319對(duì)植物脅迫具有抗性。酸性土壤作物損失的主要原因是鋁(Al)的毒性，miR319可通過(guò)調(diào)節(jié)亞麻植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程從而在Al脅迫反應(yīng)中起重要作用。有研究表明：亞麻幼苗在pH 4.5下浸泡在含AlCl3的溶液，經(jīng)過(guò)24 h后發(fā)現(xiàn)其miR319表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明miR319參與植物脅迫調(diào)控過(guò)程，其潛在靶標(biāo)是TCP基因[13]。水稻是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，其生產(chǎn)經(jīng)常受到冷脅迫的影響，冷脅迫嚴(yán)重抑制水稻幼苗的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致不均勻成熟。水稻miR319基因家族由2個(gè)成員Osa-miR319ba和Osa-miR319bc組成。有研究表明：Osa-miR319bc的表達(dá)下降受冷應(yīng)激的控制，相反過(guò)表達(dá)的Osa-miR319bc導(dǎo)致水稻對(duì)冷應(yīng)激的耐受性增強(qiáng)，如水稻的葉片更寬，有較高的存活率和脯氨酸含量。OsPCF6和OsTCP21可能是Osa-miR319bc靶向基因，研究表明Osa-miR319bc可能是通過(guò)靶向OsPCF6和OsTCP21在植物對(duì)冷應(yīng)激反應(yīng)起的重要作用[14]。miR319還控制植物對(duì)干旱和鹽度脅迫的反應(yīng)。研究表明在鹽脅迫下(200 mM NaCl)正常水稻在處理16 d后觀察到嚴(yán)重的組織損傷，而Osa-miR319ba轉(zhuǎn)基因水稻的損傷不明顯；在去除脅迫后，Osa-miR319ba轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)生長(zhǎng)，而對(duì)照植物中只有幾個(gè)分蘗存活，這說(shuō)明miR319過(guò)表達(dá)可以提高水稻抗鹽性[15]。茉莉酸作為系統(tǒng)性信號(hào)分子對(duì)番茄根結(jié)線蟲病有效，可以減少線蟲入侵的根結(jié)數(shù)。此外，有研究人員發(fā)現(xiàn)番茄植株被根結(jié)線蟲侵染后，其葉和莖組織中的TCP和控制茉莉酸合成的掛件基因上調(diào)表達(dá)，而miR319下調(diào)表達(dá)，這說(shuō)明miR319bc參與植物防御害蟲的調(diào)控過(guò)程[16]。以上研究表明miR319對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和植物抗病、抗寒等抗逆的機(jī)制起重要的調(diào)控作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文釆用生物信息學(xué)法對(duì)miR319基因家族成員進(jìn)行同源性分析和靶基因預(yù)測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為研究miR319靶基因的功能和相關(guān)生理作用機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR319基因家族成員序列檢索

從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.miRbase.org/index.shtml)中下載miR319基因家族的全部成員的成熟序列并進(jìn)行分析。

1.2 miR319基因家族成員的多序列比對(duì)

利用在線工具Clustalw(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)對(duì)miR319基因家族的成熟序列進(jìn)行多序列比對(duì)并分析。

1.3 miR319基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用MEGA5.1軟件以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對(duì)miR319基因家族成員的成熟序列生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 miR319的靶基因預(yù)測(cè)

利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)、BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)2種在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR319的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。將玉米、水稻、大豆的miR319序列通過(guò)psRNATarget數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)出相應(yīng)的靶基因名稱及靶基因序列，獲得的靶基因序列通過(guò)NCBI的BLAST預(yù)測(cè)其靶基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR319基因家族分析

釆用生物信息學(xué)的方法，從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索所有物種miR319的成熟序列，結(jié)果見表1。由表1可知：36種植物中存在miR319，miR319在不同植物中拷貝數(shù)差異較大，其中大豆的miR319序列最多，為17條；其次為毛果楊，其miR319有9條；木薯的miR319有8條；小立碗蘚、葡萄、無(wú)油樟的miR319為5條；蒺藜狀苜蓿、玉米、蓖麻、琴葉擬南芥、香瓜的miR319均為4條；番茄、擬南芥、蘋果、馬鈴薯的miR319均為3條；高粱、二穗短柄草、水稻、豇豆、亞麻、煙草、水蜜桃的miR319均為2條；其余物種的miR319均為1條。

基因定位表明，大部分miR319基因分散在不同的染色體上，也有少部分分散在同一條染色體上，如zma-miR319a-3p、zma-miR319b-3p和zma-miR319c-3p、zma-miR319d兩組基因分別定位在玉米的3號(hào)、8號(hào)染色體上；sbi-miR319a、sbi-miR319bc都定位在高粱的3號(hào)染色體上；mtr-miR319a-3p、mtr-miR319b-3p都定位在蒺藜狀苜蓿的5號(hào)染色體上；osa-miR319a-3p、osa-miR319bc都定位在水稻的1號(hào)染色體上；gma-miR319g、gma-miIR319h都定位在大豆的2號(hào)染色體上，gma-miR319o、gma-miR319p都定位在大豆的6號(hào)染色體上，gma-miR319j、gma-miR319k都定位在大豆的11號(hào)染色體上。其余miR319所有成員只在一種染色體上。此外其余22個(gè)物種的基因無(wú)法定位。

表1 36個(gè)模式物種中miR319的成熟序列

續(xù)表1 Continued table 1

物種SpeciesmiRNA名稱Name of miRNA成熟序列Maturesequence基因定位Genelocation+/-gma-miR319jUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr11:1374020-1374198+gma-miR319kUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr11:32902062-32902247+gma-miR319lUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUCchr17:9436178-9436279-gma-miR319mUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr18:4278883-4279072-gma-miR319nUUUGGACCGAAGGGAGCCCCUchr13:27068589-27068684-gma-miR319oUGGACUGAAGGGGAGCUCCUUCchr6:11433545-11433739-gma-miR319pUUUUGGACUGAAGGGAGCUCCchr6:22581697-22581775+gma-miR319qUGGACUGAAGGGAGCUCCUUC未知未知玉米zma-miR319a-3pUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr3:212116898-212117106+Zea mayszma-miR319b-3pUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr3:2801942-2802154+zma-miR319c-3pUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr8:148277363-148277578-zma-miR319dUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr8:26767956-26768167-毛果楊ptc-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_1:7887933-7888120-Populus trichocarpaptc-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_3:13875330-13875514+ptc-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_13:15551280-15551475+ptc-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_19:15846565-15846757+ptc-miR319eUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_12: 4980083-4980274-ptc-miR319fUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_13: 8843265-8843466+ptc-miR319gUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_19:10665338-10665541+ptc-miR319hUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_15: 7395415-7395609+ptc-miR319iUUGGGCUGAAGGGAGCUCCCscaffold_6: 24889057-24889145+小立碗蘚ppt-miR319baCUUGGACUGAAGGGAGCUCCscaffold_19:89704-89872+Physcomitrella patensppt-miR319bcCUUGGACUGAAGGGAGCUCCscaffold_234: 55730-55889-ppt-miR319cCUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_29: 1728494-1728682-ppt-miR319d-3pCUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_266: 191734-191903+ppt-miR319eCUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_99: 433971-434144+江南卷柏Selaginella moellendorffiismo-miR319UGCUGCCGACUCAUGCAUCC未知未知葡萄vvi-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr1:4189562-4189755+Vitis viniferavvi-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr2:855561-855742-vvi-miR319eUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUchr11:4317224-4317330+vvi-miR319fUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr6:9137255-9137447+vvi-miR319gUUGGACUGAAGGGAGCUCCCAchr17:3675978-3676199-菜豆Phaseolus vulgarispvu-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCUU未知未知藍(lán)花耬斗菜Aquilegia caeruleaaqc-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知枳Citrustrifoliatactr-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知蓖麻rco-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU30190:3280054-3280264-Ricinus communisrco-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU29932:22062-22240+rco-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU28606:5923-6110-rco-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCUU28207:60971-61157+琴葉擬南芥aly-miR319a-5pAGAGCUUCCUUGAGUCCAUUCGL348719.1:7941288-7941508-Arabidopsis lyrataaly-miR319b-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUGL348719.1:21388787-21389032+aly-miR319c-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUGL348716.1: 19899133-19899403+

續(xù)表1 Continued table 1

物種SpeciesmiRNA名稱Name of miRNA成熟序列Maturesequence基因定位Genelocation+/-aly-miR319d-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUGL348716.1: 18166558-18166824+小麥Triticum aestivumtae-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知甜橙Citrus sinensiscsi-miR319UUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知可可Theobroma cacaotcc-miR319UUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知大葉相思Acacia auriculiformisaau-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知豇豆Vigna unguiculatavun-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知vun-miR319bcCUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知刺苞菜薊Cynar acardunculuscca-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知亞麻lus-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知Linum usitatissimumlus-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知煙草nta-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知Nicotiana tabacumnta-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知水蜜桃Prunus persicappe-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCKB639086.1:17220683-17220922+ppe-miR319bcUAGCUGCCGAGUCAUUCAUCCAKB639086.1: 11602985-11603085-橡膠樹Hevea brasiliensishbr-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCUKB629150.1:30162-30382+蘋果mdm-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr14:17485432-17485626+Malus domesticamdm-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知mdm-miR319cAUCCAACGAAGCAGGAGCUGA未知未知香瓜cme-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知Cucumis melocme-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知cme-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知cme-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知木薯mes-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold10493:48255-48431-Manihot esculentames-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold10122: 61588-61763+mes-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold06557:7971-8204+mes-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold03429: 24109-24350+mes-miR319eUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold03264: 101781-101954-mes-miR319fUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUscaffold06446: 168758-168933-mes-miR319gUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUscaffold03454: 69872-70096-mes-miR319hCUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold02877: 33218-33397-馬鈴薯stu-miR319UUGGACUGAAGGGUUCCCUUCJH137816.1:1868464-1868640+Solanum tuberosumstu-miR319a-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUJH137840.1: 1381096-1381267+stu-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCUJH137816.1: 2292041-2292213-番木瓜Carica papayacpa-miR319AUUGGACUGAAGGGAGCUCC未知未知無(wú)油樟atr-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold00077:2616711-2616892+Amborella trichopodaatr-miR319bcUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold00081: 2902538-2902653+atr-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold00105: 1160459-1160636+atr-miR319dUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold00188: 77604-77748-atr-miR319eUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold00188: 92741-92885-蕪菁Brassica rapabra-miR319-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchrA1:7428122-7428320+山羊草Aegilops tauschiiata-miR319-3pACUGGAUGACGCGGGAGCUAAKD515090.1:6407-6597+

2.2 miR319基因家族成員的多序列比對(duì)及保守位點(diǎn)分析

利用在線工具Clustal w對(duì)miR319家族進(jìn)行成熟序列的比對(duì)，結(jié)果見圖1。由圖1可知：36個(gè)物種中miR319成熟序列的相似度較高，保守序列為“UUGGACUGAAGGG”。堿基方面，玉米的第183位堿基由A變成了U；高粱的第204位堿基由A變成了U；馬鈴薯的第165位堿基由A變成了U，第166位堿基由G變成了U，第168堿基由U變成了C，這可能由于進(jìn)化過(guò)程中的基因突變問(wèn)題導(dǎo)致。位置方面，可可、甜橙的miR319堿基位置均勻分布在90～120位；木薯、煙草、亞麻、擬南芥、葡萄、藍(lán)花耬斗菜、枳、香瓜、無(wú)油樟、毛果楊、大豆、馬鈴薯這12個(gè)物種中的miR319堿基位置均勻分布在150～180位；蘋果、刺苞菜薊、豇豆、大葉相思、玉米的miR319堿基位置均勻分布在180～200位；橡膠樹、蓖麻、小麥、水蜜桃、高粱、番木瓜、火炬松的miR319堿基位置均勻分布在200～230位；蕪菁、蒺藜狀苜蓿的miR319堿基位置均勻分布在20～50位；菜豆的位置分布差異與其他物種差異較大，其miR319堿基位置分布在410～430位。以上結(jié)果表明，miR319在不同物種間具有高度的保守性，保守區(qū)位置分布差異較大。

圖1 miR319基因家族成員成熟序列的比對(duì)結(jié)果Fig.1 Multiple alignment result of the mature sequence in miR319 gene family members

圖2 基于NJ法構(gòu)建的miR319基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the miR319 gene family based on the NJ method

2.3 miR319基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA5.1軟件采用鄰接法對(duì)miR319基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行分子進(jìn)化規(guī)律的研究，結(jié)果見圖2。由圖2可知：miR319基因家族的成員呈現(xiàn)為4個(gè)大的分支。琴葉擬南芥aly-miR319a-5p、蒺藜狀苜蓿mtr-miR319d-5p、二穗短柄草bdi-miR319ba分為一支；水蜜桃ppe-miR319bc和江南卷柏smo-miR319分為一支；山羊草ata-miR319-3p、水稻osa-miR319a-3p、蘋果mdm-miR319c分為一支；其余基因均在同一分支。其中，除水稻osa-miR319a-3p和蘋果mdm-miR319c分別與其他osa-miR319、mdm-miR319親緣關(guān)系較遠(yuǎn)外，其余基因均聚集在一個(gè)分支上，因此推測(cè)這2個(gè)基因可能有特殊的進(jìn)化機(jī)制，值得探討。

2.4 miR319的靶基因預(yù)測(cè)分析

本文以大豆、水稻、玉米3個(gè)物種的miR319為模板，利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)、BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)2個(gè)在線網(wǎng)站對(duì)miR319的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。由表2可以看出，從psRNATarget數(shù)據(jù)庫(kù)共檢測(cè)出37個(gè)靶基因，通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)miR319基因家族的靶基因功能主要有轉(zhuǎn)錄因子、翻譯活化劑、還原酶等。其中玉米miR319靶基因功能為PCF8、PCF6轉(zhuǎn)錄因子；水稻miR319靶基因功能為GCN1的翻譯活化劑、還原酶、PCF6轉(zhuǎn)錄因子、蛋白酶；大豆miR319靶基因功能為TCP2、TCP3、TCP4轉(zhuǎn)錄因子、還原酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白激酶。這說(shuō)明miR319主要通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄因子影響及調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、植物激素合成和抗逆作用。

表2 miR319的靶基因及其功能預(yù)測(cè)結(jié)果

續(xù)表2 Continued table 2

物種Species靶基因名稱Acc of target gene靶基因功能Function of target geneTC420951acyl-CoA-binding domain-containing protein 4含酰基輔酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)4TC422594acyl-CoA-binding domain-containing protein 4含?；o酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)4TC484251transcription factor GAMYB 轉(zhuǎn)錄因子GAMYBTC492929transcription factor TCP2 轉(zhuǎn)錄因子TCP2TC469605transcription factor TCP2轉(zhuǎn)錄因子TCP2TC431263boron transporter 2 硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2TC425794fructose 1,6-bisphosphate aldolase 果糖1,6-二磷酸醛縮酶HO018779DUF506 family protein DUF506家族蛋白TC443617DUF506 family protein DUF506家族蛋白TC433197polyadenylate-binding protein RBP45 聚腺苷酸結(jié)合蛋白R(shí)BP45TC465063Putative LRR receptor-like serine/threonine-protein kinaseLRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶GD676785transcription factor TCP4 轉(zhuǎn)錄因子TCP4TC469484heavy metal transport/detoxification superfamily protein重金屬運(yùn)輸/解毒超家族蛋白TC430271nicotinamide adenine dinucleotide transporter 1煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1

3 討 論

miR319靶基因的功能主要是TCP轉(zhuǎn)錄因子。TCP家族成員都含有TCP保守結(jié)構(gòu)域并編碼結(jié)構(gòu)相似的蛋白，其中由59個(gè)氨基酸組成的bHLH結(jié)構(gòu)是結(jié)合DNA和蛋白互作所必需的[17]。TCP 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)其功能域和 DNA 及其它蛋白間的相互作用，激活或抑制基因的表達(dá)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成以及對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用[18]。TCP家族轉(zhuǎn)錄因子與植物細(xì)胞的分化和發(fā)育有密切關(guān)系。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析52個(gè)蘋果TCP家族成員發(fā)現(xiàn)，MdTCP22、MdTCP35、MdTCP47、AtTCP20等基因可能在蘋果生長(zhǎng)發(fā)育及代謝過(guò)程中起作用；MdTCP8、MdTCP9、MdTCP10、MdTCP11等基因可能作為 miRNA的靶基因參與蘋果葉片的發(fā)育[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)ClTCP14a和ClTCP15基因在西瓜植增高過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控功能，ClTCP1a，ClTCP2a，ClTCP16，ClTCP20a，ClTCP21基因可能在西瓜葉片衰老的調(diào)控中起著重要作用[20]。以上研究都表明TCP在植物發(fā)育中起重要作用。

而miR319通過(guò)其靶基因TCP來(lái)控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)TCP24在擬南芥花器官和根部的次生壁增厚起負(fù)調(diào)控作用。擬南芥中miR319ba的靶基因是TCP24，過(guò)表達(dá)的TCP24破壞了擬南芥花藥內(nèi)皮中次生細(xì)胞壁的增厚過(guò)程，導(dǎo)致雄性不育，花藥開裂和花粉釋放。這表明TCP24是作為次生壁增厚的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)花藥內(nèi)皮發(fā)育過(guò)程[21]。YUC5是涉及生長(zhǎng)素生物合成的基因，有研究表明TCP4可直接激活YUC5轉(zhuǎn)錄，并將生長(zhǎng)素生物合成的信號(hào)通路整合到促進(jìn)擬南芥下胚軸中細(xì)胞伸長(zhǎng)的油菜素固醇分子信號(hào)通路中。此外，TCP4還調(diào)節(jié)生物素-油菜素類固醇信號(hào)傳導(dǎo)下游通路，以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而miR319通過(guò)靶向TCP來(lái)調(diào)控?cái)M南芥下胚軸生長(zhǎng)，從而控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育[22]。RBE基因是控制擬南芥花瓣生長(zhǎng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，最新研究還發(fā)現(xiàn)RBE基因和miR319共同作為TCP的上游調(diào)控基因來(lái)控制擬南芥花瓣的早期發(fā)育過(guò)程，這說(shuō)明植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[23]。此外TCP還調(diào)控茉莉酸信號(hào)通路，植物中脫落酸、吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素、乙烯經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)通路傳遞到miR319，miR319控制轉(zhuǎn)錄因子TCPs，TCPs控制脂肪氧合酶2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)衰老葉中的茉莉酸濃度，表明植物激素通過(guò)控制TCP來(lái)控制葉片衰老過(guò)程[24]。

此外，MYB類轉(zhuǎn)錄因子也是miR319的靶基因。有研究表明木薯中的miR319與4個(gè)靶基因之間的相關(guān)系數(shù)從大到小的順序?yàn)椋篗YB33>Unknown> TCP4>GSTU8，這說(shuō)明MYB33和Unknown 2個(gè)靶基因是木薯miR319a更為優(yōu)先的調(diào)控目標(biāo)。關(guān)于miR319對(duì)MYB33 和Unknown 兩個(gè)靶基因的調(diào)控作用使木薯適應(yīng)低溫逆境的機(jī)制值得深入研究[25]。此外miR319靶基因其他的功能如還原酶、蛋白激酶、翻譯活化劑等還需要相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本文通過(guò)生物信息方法對(duì)miR319基因家族成員序列分析表明大部分miR319基因分散在不同的染色體上，也有少部分分散在同一條染色體上，miR319序列在不同物種間具有高度的保守性，保守區(qū)位置分布差異較大；進(jìn)化分析表明miR319基因家族的成員呈現(xiàn)為4大分支，水稻osa-miR319a-3p和蘋果mdm-miR319c有特殊的進(jìn)化機(jī)制；靶基因預(yù)測(cè)表明miR319靶基因功能包括轉(zhuǎn)錄因子、翻譯活化劑、還原酶、蛋白酶等，在植物體內(nèi)可能形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。以上結(jié)果為今后進(jìn)一步研究miR319靶基因調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制提供了理論依據(jù)。