TM9SF3在肺腺癌中的表達和臨床意義

俞華林，許映華*，王明偉，李曙光，張雯雯，楊勁松，李偉

0 引言

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的一種原發(fā)性惡性腫瘤，也是死亡率最高的癌種[1]。小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是其主要的病理類型，而肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是NSCLC中最常見的類型。近年來，免疫治療可以有效地提高LUAD患者的生存時間[2]。免疫療法通過控制腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）內(nèi)外的免疫細胞來識別和殺死癌細胞[3]。然而，現(xiàn)有的免疫療法仍存在一定的局限性（如敏感度低和特異度不高等），有效率僅在25%左右，亟需探尋更多的新靶點。

跨膜蛋白9超家族（TM9SF）的結(jié)構(gòu)是由一個大的N端胞外結(jié)構(gòu)域和9個假定的跨膜結(jié)構(gòu)域組成，該家族蛋白在進化上非常保守[4]，在哺乳動物中有四個成員（TM9SF1-TM9SF4）[5]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)TM9SF在免疫細胞的黏附和吞噬調(diào)控中起重要作用[6]。例如，TM9SF3蛋白能夠促進T細胞性白血病細胞增殖和侵襲[7]。然而，TM9SF3在肺腺癌患者中的表達情況及其對免疫微環(huán)境的影響目前尚未見報道。因此，本研究通過納入癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中肺癌患者臨床數(shù)據(jù)和測序數(shù)據(jù)，分析TM9SF的表達及其預(yù)后價值。經(jīng)多個數(shù)據(jù)庫分析，進一步確定TM9SF3的表達對免疫微環(huán)境的影響，旨在發(fā)現(xiàn)肺腺癌新的預(yù)后生物標志物，為患者的免疫治療提供更多的選擇靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集南通大學附屬南通第三醫(yī)院2021年6月—2021年11月經(jīng)病理確診的肺腺癌患者組織9例（肺癌組），所有患者均為初次診斷，其中男5例、女4例，年齡45～81歲。同時收集距離癌組織5 cm以上的正常肺組織6例作為正常對照組（NT組）。納入標準：（1）已通過組織病理學確診為LUAD的患者；（2）患者在就診前未接受任何與肺癌相關(guān)的手術(shù)治療、放射治療或化學治療等其他手段的綜合治療；（3）患者年齡≥18歲。排除標準：（1）患者合并有系統(tǒng)的惡性腫瘤；（2）患者既往已經(jīng)進行過相關(guān)抗腫瘤治療；（3）臨床資料不完整；（4）患者基礎(chǔ)狀況差。其中，6例患者的樣本用于提取RNA做qRT-PCR實驗，3例患者的樣本用于提取蛋白做免疫印跡實驗。本研究遵循《赫爾辛基宣言》原則，并經(jīng)過了南通大學附屬南通第三醫(yī)院倫理委員會的審閱和批準，所有參與者均簽署書面知情同意書。

1.2 公共數(shù)據(jù)收集和預(yù)處理

收集來自TCGA數(shù)據(jù)庫中497例LUAD患者和54例癌旁對照組織樣本的基因表達譜數(shù)據(jù)，對所有數(shù)據(jù)進行歸一化處理去除丟失和重復的結(jié)果，排除年齡、性別、總生存（OS）時間、TNM分期和遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)缺失或不足的樣本。GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://GEPIA.cancerpku.cn/index）整合了來自TCGA和GTEx的33種惡性腫瘤9 736例腫瘤樣本和8 587例正常樣本中的RNA測序表達數(shù)據(jù)[8]，用于分析TM9SF3表達與LUAD患者的臨床病理特征之間的相關(guān)性。人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫（HPA）（www.proteinatlas.org）匯總?cè)梭w組織中免疫組織化學圖譜，用于分析LUAD患者正常肺組織和癌組織中TM9SF3的表達和分布情況[9]，及其對LUAD患者預(yù)后的影響。

1.3 實驗試劑

兔抗人TM9SF3抗體購自美國Abcam公司，兔來源內(nèi)參一抗抗體GAPDH和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體購自中國愛博泰克公司，ECL超敏化學發(fā)光液購自中國諾唯贊公司。TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國賽默飛公司，SYBN Green Master Mix購自美國ABI公司，引物設(shè)計由中國銳博公司進行設(shè)計。

1.4 基因集合富集分析

在從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的TM9SF3低表達和高表達相關(guān)基因的數(shù)據(jù)集中進行基因集合富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA），分析從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的歸一化RNA測序數(shù)據(jù)。首先，GSEA是針對兩組樣本中測序的所有基因進行富集分析，在其輸入的基因表達矩陣中，樣本被分成A和B兩組，通過對所有基因排序來表示基因在兩組間表達量的變化趨勢。我們根據(jù)標準化富集評分（normalized enrichment score,NES）選擇最豐富的信號通路，并分別以GO富集KEGG通路的形式進行展示，以探索TM9SF3的潛在生物學功能。

1.5 免疫浸潤分析

使用TIMER數(shù)據(jù)庫中的生存模塊探索LUAD生存結(jié)果與免疫細胞表達量之間的關(guān)系。此外，采用體細胞拷貝數(shù)變化（somatic copy number alteration,SCNA）模塊研究TM9SF3細胞SCNA與6種免疫細胞表達的相關(guān)性。同時，通過CIBERSORT算法和TIMER數(shù)據(jù)庫進行免疫浸潤分析，展示LUAD中免疫微環(huán)境的標志物表達變化，計算LUAD樣本中22種免疫細胞的表達變化。通過R軟件vioplot軟件包顯示22個高、低TM9SF3樣本中免疫細胞的比例差異。

1.6 免疫印跡實驗檢測蛋白表達

將收集的3例患者組織樣本置于冰上，PBS清洗后，加入200 μl蛋白裂解液（CM/RIPA比值為1/100）置冰上研磨；提取蛋白上清液后，采用BCA試劑盒檢測蛋白上樣量；凝膠電泳（80 V轉(zhuǎn)120 V）分離蛋白；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（250 mA，2 h），隨后將PVDF膜用封閉液室溫封閉2 h；根據(jù)抗體說明書配置一抗稀釋液（TM9SF3,1:1 000；GAPDH，1:6 000），并置于4℃冰箱進行孵育過夜。次日，用TBST緩沖液漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔（二抗，1:10 000），室溫孵育2 h 。最后加入顯影劑進行曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參計算目的蛋白表達的灰度值。

1.7 qRT-PCR實驗

根據(jù)TRIzol試劑盒的步驟提取6例患者組織的總RNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μl（包括5 μl SYBR Green Master Mix，1 μl引物，1 μl cDNA和3 μl的無RNA酶水），反應(yīng)條件：UDG酶50℃培養(yǎng)120 s；95℃預(yù)變性120 s；95℃變性15 s，40個循環(huán)；60℃退火15 s；72℃延伸60 s。同時，以GAPDH作為內(nèi)參，比較各組中mRNA和相應(yīng)內(nèi)參的Ct值，用2-△△Ct分析表達情況，實驗均重復3次。TM9SF3引物：上游引物為5’-TGCCAGCCACTTACTGTGAAA-3’，下游引物為5’-GCCTCACCAACAATACCCCATA-3’。GAPDH引物：上游引物為5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’，下游引物為5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’。

1.8 統(tǒng)計學方法

使用R（v.3.6.2）的“生存”包處理從TCGALUAD下載的生存信息，并通過Kolmogorov Smirnov檢驗評估臨床病理特征與TM9SF家族分子表達之間的關(guān)系。通過使用未配對的Student’st檢驗比較LUAD患者癌組織和癌旁樣品中的TM9SF3表達。根據(jù)TM9SF3基因mRNA表達中位數(shù)將LUAD患者分為高表達組和低表達組。采用Kaplan Meier法分析TM9SF3表達與臨床預(yù)后之間的相關(guān)性。Cox回歸模型Log rank檢驗檢驗TM9SF3高表達組和低表達組LUAD患者的OS是否存在差異，并計算風險比（hazard ratio,HR）。P<0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學意義，檢驗水準α=0.05。上述數(shù)據(jù)資料符合正態(tài)分布（Shapiro-Wilk檢驗P≥0.05），且方差齊性（Levene’s檢驗P≥0.05）數(shù)據(jù)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TM9SF3在LUAD和泛癌中的表達及其預(yù)后分析

結(jié)果顯示，與NT組相比TM9SF3在LUAD中表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1B。Kaplan-Meier Plotter分析發(fā)現(xiàn)，TM9SF3高表達的患者總生存率顯著低于低表達患者（P=0.003），見圖1C。上述結(jié)果表明，高表達的TM9SF3導致LUAD患者的預(yù)后更差。當TM9SF3表達增多時，LUAD患者的HR值變高，表明高表達的TM9SF3是肺腺癌患者的獨立危險因素，起促癌的作用；同時，腫瘤的臨床分期也具有較高的危險因素，見圖1A。LUAD患者邏輯回歸分析證實，腫瘤分期越高，患者風險越高（表格略，請掃描本文OSID二維碼）。

此外，我們發(fā)現(xiàn)TM9SF3 在肝細胞癌（LIHC）、胃腺癌（STAD）、肺腺癌和膽管癌（CHOL）中呈現(xiàn)高表達；而在乳腺癌（BRCA）、腎嫌色細胞（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、甲狀腺癌（THCA）和子宮內(nèi)膜癌（UCEC）中呈低表達的趨勢，見圖1D。

2.2 高表達的TM9SF3與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性

結(jié)果顯示，在年齡<60歲、女性、臨床分期Ⅰ+Ⅱ和T分期早的患者中，TM9SF3的表達明顯偏低（P<0.05）；而在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0～N3）和有無遠處轉(zhuǎn)移（M0和M1）的LUAD患者分組中，TM9SF3的表達在兩組中差異無統(tǒng)計學意義（P=0.291,P=0.213）。隨著LUAD患者臨床病理分期的增加，TM9SF3基因顯著上調(diào)（P=0.0471）。TM9SF3高表達的患者總體生存率低，相對風險度也較高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.0064,P=0.0034）（圖片請掃描本文OSID碼）。

2.3 驗證TM9SF3在LUAD患者的癌與癌旁正常組織中的表達

LUAD患者TM9SF3的蛋白和mRNA水平表達在腫瘤組織中明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P=9.90E-09），見圖2A～B；此外，患者的年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義（t=0.488,P=0.638）。LUAD組織樣本中TM9SF3蛋白免疫組織化學染色較深，表明TM9SF3的蛋白表達在LUAD樣本中較高，見圖2C。

2.4 GSEA分析與TM9SF3相關(guān)的細胞信號通路

GSEA分析顯示，GO注釋揭示了與TM9SF3的表達呈正相關(guān)的5個主要的蛋白生物學功能：T細胞介導的細胞毒性、巨噬細胞遷移、巨噬細胞趨化作用、白三烯生物合成過程、抗原刺激引起的急性炎性反應(yīng)。此外，還發(fā)現(xiàn)了5個負相關(guān)的主要的蛋白生物學功能：磷脂酰肌醇結(jié)合、蛋白質(zhì)靶向液泡、調(diào)節(jié)細胞極性的建立或維持、靶向囊泡、蛋白質(zhì)脫甘露糖基化。KEGG通路富集分析顯示與TM9SF3表達正相關(guān)最強的5條信號通路：氧化磷酸化、產(chǎn)生IGA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、自身免疫性甲狀腺疾病、造血、抗原加工和呈遞。負相關(guān)最強的5個通路是：黏附連接、WNT信號通路、TGFβ信號通路、泛素介導的蛋白水解、磷酸肌醇代謝（圖片請掃描本文OSID碼）。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)TM9SF3表達的變化能夠參與調(diào)控免疫細胞相關(guān)的信號通路。

2.5 TM9SF3的異常表達對LUAD組織免疫微環(huán)境的影響

為了明確TM9SF3是否與細胞內(nèi)部的免疫相關(guān)的信號通路有關(guān)聯(lián)，本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫驗證TM9SF3與LUAD患者B細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的表達具有相關(guān)性，見圖3A；同時，B細胞和DC細胞免疫浸潤的比例變化會影響LUAD患者的預(yù)后，提示TM9SF3調(diào)控的免疫過程可能影響LUAD患者的預(yù)后，見圖3B。此外，TM9SF3的拷貝數(shù)變異與B細胞、CD4+T細胞和DC免疫細胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)主要由臂級增益（arm-level gain）來驅(qū)動，也顯示出TM9SF3對LUAD免疫微環(huán)境的影響，見圖3C。以上表明TM9SF3通過調(diào)節(jié)免疫細胞浸潤比例的變化影響LUAD患者的預(yù)后。

除此之外，我們還對下載的LUAD患者數(shù)據(jù)中TM9SF3高/低表達后的22種免疫細胞的表達豐度進行展示，結(jié)果顯示，當TM9SF3表達增加時，會導致CD8+T細胞（P=0.004）和CD4記憶激活T細胞（P=0.012）相關(guān)標志物的表達升高；而在TM9SF3低表達組中，漿細胞（P<0.019）、CD4記憶靜息T細胞（P=0.029）和調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）（P=0.024）的比例更高，見圖3D。我們還利用TIMER中的“共表達”模塊分析揭示了TM9SF3的表達改變對免疫細胞表面標志物的表達影響（表格略，請掃描本文OSID二維碼）。

圖3 差異表達的TM9SF3與免疫細胞浸潤的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis between differentially-expressed TM9SF3 and immune cells in LUAD tissues

綜上所述，TM9SF3不僅能夠影響B(tài)細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞和T細胞等免疫細胞的浸潤水平，而且與各種免疫細胞表面標志物表達之間的相關(guān)性都表明TM9SF3作為免疫治療的新靶點的潛力和價值。

3 討論

近年來，免疫治療使肺癌的治療進入了全新的時代，為肺癌患者迎來了曙光。研究顯示，隨著免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）的廣泛應(yīng)用，ICIs聯(lián)合化療給手術(shù)切除的早期非小細胞肺癌患者增加了更多痊愈的機會[10-11]；對于晚期NSCLC患者，免疫治療也能將其5年總體生存率由5%提升至15.5%～23.2%，特別對于程序性死亡受體配體1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）高表達的晚期NSCLC患者，多項臨床試驗研究顯示，ICIs單藥療效明顯效優(yōu)于單純化療[12-16]。與此同時，發(fā)現(xiàn)在采取免疫治療為一線治療方案的患者中，7%～27%的患者出現(xiàn)原發(fā)耐藥，以及約25%的患者會出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥現(xiàn)象[17-18]。所以，耐藥成為當下免疫治療持續(xù)發(fā)展的一大難關(guān)。目前，針對耐藥主要考慮兩個因素：首先，體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的機制復雜；其次，預(yù)測發(fā)生率的生物標志物研究不足。所以，明確耐藥機制、篩選更多的生物學標志物是當前精準醫(yī)療時代背景下亟待解決的問題。本研究主要探究TM9SF3在肺腺癌中的表達和預(yù)后意義，同時探討了TM9SF3對免疫浸潤的影響。

本研究首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)TM9SF3的表達在LUAD中顯著升高。隨后將該家族分子的表達與肺癌患者進行生存分析研究，結(jié)果表明TM9SF3分子在肺腺癌患者中低表達時，患者生存率明顯提高。為了進一步探究和佐證TM9SF家族分子與肺腺癌預(yù)后和臨床病理特征之間的關(guān)系，我們采用多因素Cox回歸分析和邏輯回歸分析，發(fā)現(xiàn)只有TM9SF3與LUAD的預(yù)后臨床指標顯著相關(guān)。上述結(jié)果初步證明TM9SF3是一種新的促癌基因。我們也從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選了TM9SF3在泛癌中的表達，發(fā)現(xiàn)TM9SF3在多種癌癥患者樣本中高表達，其中包括肝細胞癌、LUAD胃腺癌和膽管癌。此外，我們也利用公認的GEPIA腫瘤數(shù)據(jù)庫驗證了TM9SF3的表達高低不僅與LUAD患者的總生存期差異有關(guān)，還與患者的年齡、性別、分化程度和腫瘤分期相關(guān)，并且在臨床LUAD患者樣本和人類蛋白組學圖譜中驗證了TM9SF3在肺腺癌組織中的高表達。目前，有學者研究發(fā)現(xiàn)TM9SF3不僅在胃癌組織中上調(diào)，而且與胃癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)[19]；也有研究證實TM9SF3與乳腺癌中的紫杉醇耐藥有關(guān)[20]。而在T細胞白血病中，有學者通過一系列研究證實，表達上調(diào)的TM9SF3能夠調(diào)節(jié)細胞的增殖和侵襲能力[7]。最新研究顯示，TM9SF3的下調(diào)能夠明顯抑制三陰性乳腺癌相關(guān)細胞和巖藻糖苷酶αL1所誘導的細胞增殖和遷移能力[21]。上述研究表明，TM9SF3在癌癥發(fā)生中發(fā)揮重要作用，然而，其在調(diào)控肺腺癌發(fā)生中的功能機制仍是未知領(lǐng)域。

本研究通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)通路與TM9SF3表達的相關(guān)性最強，其中包括TM9SF3與T細胞介導的細胞毒性、巨噬細胞遷移、巨噬細胞趨化性和抗原加工呈遞作用顯著正相關(guān)。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的主要參與者[22]。研究人員發(fā)現(xiàn)了M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞的募集最終促進NSCLC生長[23]。說明TM9SF3與免疫細胞的調(diào)控以及與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的通路有關(guān)，揭示其在腫瘤免疫治療中的潛在研究價值。

利用TIMER數(shù)據(jù)庫，本研究探索了TM9SF3對免疫微環(huán)境的影響，分析發(fā)現(xiàn)TM9SF3的表達增高與LUAD患者體內(nèi)的6種免疫效應(yīng)細胞的標志物異常低表達顯著相關(guān)，同時免疫效應(yīng)細胞（如B細胞和DC細胞）表達的增加和TM9SF3表達的降低，會增加肺腺癌患者的生存時間。有研究發(fā)現(xiàn)，在對LUAD患者進行免疫治療時，應(yīng)考慮腫瘤微環(huán)境中的驅(qū)動突變與B細胞反應(yīng)之間的聯(lián)系[24]。B細胞是目前研究中唯一有爭議的免疫細胞類型。一方面，它們可以產(chǎn)生與CTL活性相協(xié)調(diào)的細胞因子，并充當有效的抗原呈遞細胞（APC），但另一方面，它們可能通過產(chǎn)生細胞因子來招募髓源性抑制細胞而促進腫瘤發(fā)生[25-26]。有研究表明，腫瘤內(nèi)B細胞的主要作用模式包括將B細胞受體（BCR）同源抗原呈遞給CD4+和潛在的CD8+T細胞[27]。樹突狀細胞屬于腫瘤拮抗免疫細胞的一種，功能主要是作為特化APC[28]。這也可以解釋為什么抗原加工呈遞通路存在于TM9SF3富集KEGG途徑中。此外，我們發(fā)現(xiàn)LUAD中TM9SF3的不同突變形式與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞和DC的免疫浸潤有關(guān)。最后，本研究在表達不同的TM9SF3患者樣本中，探討22種免疫細胞的表達變化，與TM9SF3表達變化顯著相關(guān)的免疫細胞有漿細胞、CD8+T細胞、CD4+記憶活化T細胞、CD4記憶靜息T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞。上述結(jié)果表明，TM9SF3分子能夠通過影響LUAD中的免疫細胞的表達參與調(diào)節(jié)肺腺癌患者的免疫微環(huán)境。

總之，我們證明了TM9SF3在LUAD樣本中上調(diào)，其過表達與LUAD患者的不良臨床病理特征和不良預(yù)后高度相關(guān)。此外，TM9SF3被初步篩選作為LUAD預(yù)后分析中的獨立預(yù)后因素；同時，TM9SF3可能通過影響LUAD的免疫微環(huán)境，參與調(diào)節(jié)LUAD的發(fā)生發(fā)展。TM9SF3有望成為LUAD新的預(yù)后指標和免疫治療靶點。