響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖誘導(dǎo)大豆抗毒素合成條件

王凱強(qiáng)，楊雪，李常風(fēng)，段曉，彭晴，喬宇，石波*

（1.長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西長治 046000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

植物抗毒素是植物受到外源誘導(dǎo)子刺激產(chǎn)生的低分子有機(jī)化合物，屬于次生代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)出多種生物活性[1]。大豆抗毒素（glyceollins，GLYs）是豆科植物受到外源誘導(dǎo)子誘導(dǎo)合成的防御性異戊二烯化黃酮類化合物，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗雌激素等活性，后來發(fā)現(xiàn)其有調(diào)節(jié)葡萄糖與脂質(zhì)代謝、促進(jìn)藥物遞送、誘導(dǎo)成骨及保護(hù)神經(jīng)與心血管的潛在作用[2-3]，因此在醫(yī)藥、保健品、化妝品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，引起廣泛關(guān)注。

自然狀態(tài)下的健康豆科植物或種子中沒有大豆抗毒素累積或含量極低。相關(guān)研究主要采用細(xì)菌、真菌及其細(xì)胞壁提取物或代謝產(chǎn)物、重金屬、酸等誘導(dǎo)子誘導(dǎo)大豆合成GLYs[4-6]，而這些誘導(dǎo)子存在微量有機(jī)混合物或者有毒化合物，潛在威脅甚至危害人體健康，影響大豆功能產(chǎn)品的品質(zhì)[7]。典型的功能性寡糖作為益生元顯示出調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血脂血壓和血清膽固醇、促進(jìn)營養(yǎng)消化吸收和抗氧化等生理功能[8]。功能性寡糖誘導(dǎo)子誘導(dǎo)GLYs 合成的報(bào)道相對(duì)較少。低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）也稱木寡糖，是由2～7個(gè)D-木糖分子以β-1,4 糖苷鍵連接而形成的功能性寡糖，其中木二糖與木三糖較常見[9]。研究顯示，XOS能促進(jìn)人體腸道內(nèi)有益菌顯著生長，并抑制有害菌繁殖，維持腸道菌群平衡[10]。有益菌如雙歧桿菌能利用XOS 維持自身生長和增殖，其通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸來抑制有害菌繁殖[11]。XOS 也具有增強(qiáng)免疫力的活性[12]。此外，酸奶添加3.5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）XOS 能促進(jìn)大鼠對(duì)鈣、鎂和鐵等礦物元素的吸收。輕度慢性肝病患者以3.0 g·d-1服用XOS 14 d 后，血氨含量低于服用前，表明XOS有護(hù)肝功效[10]。

近年來，隨著我國人口結(jié)構(gòu)調(diào)整、生活節(jié)奏加快、工作壓力增加和飲食習(xí)慣改變，亞健康和慢性疾病趨于常態(tài)化，已成為影響人體健康的主要因素。功能性食品具有特殊的營養(yǎng)功能，為改善人體健康和慢性病營養(yǎng)干預(yù)的重要方式，具有廣闊的市場需求和發(fā)展前景[13]。大豆富含多種功能性成分，如異黃酮、多肽、低聚糖和卵磷脂，且易于獲取，因此功能性大豆食品的開發(fā)成為熱點(diǎn)[14]。值得關(guān)注的是，大豆抗毒素的外源誘導(dǎo)合成進(jìn)一步拓寬了功能性大豆食品的應(yīng)用思路。同時(shí)，GLYs活性評(píng)價(jià)的研究也要求保證一定的供試量。然而市場上缺乏商品化的GLYs 及其化學(xué)對(duì)照品，GLYs的化學(xué)合成方法尚未成熟，外源誘導(dǎo)的生物合成就成為GLYs 合成的重要方法。本課題組采用褐藻酸寡糖、纖維寡糖、低聚木糖、卡拉膠寡糖、果膠寡糖和殼聚糖誘導(dǎo)大豆合成GLYs。黑豆與大豆同屬豆類，但相關(guān)研究報(bào)道較少。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是20 世紀(jì)中后期興起的用于優(yōu)化工藝參數(shù)的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，可建立模型預(yù)測各因素和水平下的目標(biāo)響應(yīng)值和確定最佳條件，并且結(jié)合方差分析能夠評(píng)價(jià)各因素和水平及其交互效應(yīng)對(duì)響應(yīng)值的影響[15-16]，已廣泛用于豆類活性物質(zhì)提取條件的優(yōu)化[17-18]。因此，本研究以低聚木糖誘導(dǎo)黑豆合成GLYs 的含量為考察目標(biāo)，以誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度為考察單因素，在此基礎(chǔ)上利用中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）-RSM 優(yōu)化GLYs合成的誘導(dǎo)條件，為大豆抗毒素制備及功能產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黑豆 選取臨沂產(chǎn)魯黑豆2號(hào)品種的大粒黑豆（Linyi Large，LL）、濟(jì)寧產(chǎn)神農(nóng)架品種的大粒黑豆（Jining Large，JL）和黑龍江產(chǎn)哈爾濱小黑豆品種的小粒黑豆（Heilongjiang Parvule，HP）為試驗(yàn)材料。其中，臨沂產(chǎn)大粒黑豆購自臨沂市沂河路糧油市場，百粒重為39.18 g；濟(jì)寧產(chǎn)大粒黑豆購自濟(jì)寧良源坊食品有限公司，百粒重為38.43 g；黑龍江產(chǎn)小粒黑豆購自佳木斯市三江農(nóng)場，百粒重為18.96 g。

1.1.2 試劑 低聚木糖購自山東龍力生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，購自美國Fisher Scientific 公司；乙醇、甲酸為分析純，購自北京化工廠；大豆抗毒素對(duì)照品由課題組制備得到。

1.1.3 儀器 2695 型HPLC 儀（配備2996 型PDA檢測器）與Xevo TQ-S 型UPLC-MS∕MS 儀，美國Waters公司；Sykam S1125型半制備HPLC儀（配備S3245 型UV∕Vis 檢測器），德 國Sykam公司；SORVALL?RC-6 Plus 型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司；ETS-D4型加熱磁力攪拌器，德國IKA 公司；3K15型醫(yī)用離心機(jī)，德國Sigma公司；SF-3120 型自動(dòng)分部收集器，日本Advantec 公司；LGJ-18型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興公司；DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；ZWY-2102 型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆抗毒素誘導(dǎo)與合成確認(rèn) ①XOS 誘導(dǎo)。黑豆誘導(dǎo)方法參照文獻(xiàn)[19]，無霉斑、粒徑一致且顆粒飽滿的黑豆用75%乙醇處理3 min，滅菌蒸餾水清洗若干次，置于25 ℃左右的滅菌水中浸泡5 h；然后用無菌刀片將膨脹的種子分為2 片子葉，在子葉表面劃出約9～12 mm2的傷口，且背面不發(fā)生破裂；將子葉置于培養(yǎng)皿內(nèi)潤濕的無菌濾紙上，向傷口內(nèi)加入60μL無菌過濾XOS溶液并用封口膜密封，在相對(duì)濕度（relative humidity，RH）65%、24～26℃條件下暗培養(yǎng)若干天。對(duì)照黑豆子葉處理方法如上，傷口加入60μL滅菌水。樣品的提取參照文獻(xiàn)[19]方法，步驟如下：子葉經(jīng)凍干研磨后，稱取0.3 g 粉末于離心管中，以料液比（g·mL-1）為1∶6的比例加入1.8 mL 80%乙醇，蓋嚴(yán)并浸在50 ℃水浴中，磁力攪拌提取1 h，以15 000 r·min-1離心15 min，取上清液過0.22μm 有機(jī)濾膜，即得粗提液。

②大豆抗毒素合成確認(rèn)。粗提液經(jīng)半制備HPLC 儀-收集器分離餾分、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS∕MS）確認(rèn)[19]。半制備HPLC 方法采用Waters 600E（配備Waters PAD 檢測器）；YMC-Pack ODS-AQ C18（20 mm×250 mm，5μm）制備色譜柱（美國YMC 公司）；流動(dòng)相A、B為90%乙腈水與5%乙腈水，流速3.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積2 mL，波長285 nm，檢測時(shí)間90 min。梯度洗脫：0～10 min，100%B；10～70 min，100%B→0%B；70～90 min，0%B。大豆抗毒素含量測定采用Waters 2695 HPLC-2996 PDA 檢測器及色譜工作站；SunChrom 反相C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）（北京金歐亞科技發(fā)展有限公司），柱溫40 ℃；流動(dòng)相A、B 為pH 3.0 乙酸水與乙腈，流速1.0 mL·min-1，洗脫方法如表1所示；進(jìn)樣體積10μL，波長285 nm，檢測時(shí)間65 min。含量計(jì)算依據(jù)課題組建立的大豆抗毒素積分值（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）的回歸方程[20]：Y=1.0 × 107X+754.32，R2=0.999 9。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution procedure

1.2.2 3 個(gè)產(chǎn)地黑豆中大豆抗毒素誘導(dǎo)合成量的比較 不同產(chǎn)地黑豆在XOS 誘導(dǎo)含量4.0%，誘導(dǎo)時(shí)間3 d，培養(yǎng)溫度25 ℃時(shí)，比較大豆抗毒素的合成累積量。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 分別研究誘導(dǎo)時(shí)間、XOS 質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度對(duì)大豆抗毒素合成量的影響。其中，誘導(dǎo)時(shí)間單因素試驗(yàn)：XOS 質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL-1，培養(yǎng)溫度25 ℃，設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6和7 d；XOS質(zhì)量濃度單因素試驗(yàn)：誘導(dǎo)時(shí)間4 d，培養(yǎng)溫度25 ℃，設(shè)置XOS 質(zhì)量濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和8.0 g·100 mL-1；培養(yǎng)溫度單因素試驗(yàn)：誘導(dǎo)時(shí)間4 d，XOS質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL-1，設(shè)置培養(yǎng)溫度分別為17、21、25、29和33 ℃，進(jìn)行XOS 誘導(dǎo)大豆抗毒素合成條件的優(yōu)化。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 利用CCD-RSM 對(duì)大豆抗毒素合成條件進(jìn)行綜合優(yōu)化。自變量誘導(dǎo)時(shí)間（X1）、XOS 誘導(dǎo)質(zhì)量濃度（X2）及培養(yǎng)溫度（X3）編碼為五水平，即-1.682、-1、0、+1、+1.682，各因素水平為誘導(dǎo)時(shí)間2～6 d、XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度3.0～7.0 g·100 mL-1、培養(yǎng)溫度17～33 ℃（表2）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)含20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（14個(gè)析因點(diǎn)和6個(gè)零點(diǎn)）（表3）。在響應(yīng)面試驗(yàn)中，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行三因素五水平的CCD-RSM試驗(yàn)，獲得XOS誘導(dǎo)黑豆子葉中大豆抗毒素累積量的優(yōu)化條件及其下的預(yù)測值。此外，對(duì)模型的顯著性與適用性進(jìn)行方差分析。

表2 中心組合設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels for central composite design

1.2.5 優(yōu)化條件驗(yàn)證 對(duì)獲得最高誘導(dǎo)量的大豆抗毒素優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)結(jié)果與軟件獲得的預(yù)測值是否一致。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆抗毒素合成確認(rèn)

在XOS 誘導(dǎo)子葉組織而獲得提取物的HPLC譜圖中，新產(chǎn)生化合物的色譜峰保留時(shí)間約在22.5 min（圖1A），相較與對(duì)照譜圖（圖1B）沒有出現(xiàn)。通過半制備HPLC 儀分離獲得受刺激子葉組織中合成的新化合物，HPLC分析確認(rèn)及純化濃縮餾分中的化合物，且利用HPLC與UPLC-MS∕MS對(duì)濃縮液進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，分離純化得到的新化合物的HPLC譜圖如圖1C所示。采用電噴霧離子源正離子（ESI+）模式下的UPLC-MS∕MS 對(duì)新化合物分析，由于3種最常見GLY異構(gòu)體Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ的分子式與分子量分別為C20H18O5與338，得出質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比（mass charge ratio,m∕z）339 是大豆抗毒素質(zhì)子化得到的準(zhǔn)分子離子[M+H]+，同時(shí)m∕z 321為[M+H]+丟失1個(gè)水分子產(chǎn)生的碎片離子[M+H-H2O]+，m∕z 229為[M+H-H2O]+丟失1個(gè)苯氧基團(tuán)產(chǎn)生的碎片離子[M+H-H2O-C6H4O]+（圖1D）。由獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到，在受到外源刺激的子葉組織提取物的色譜圖中，保留時(shí)間約22.5 min的新合成化合物確認(rèn)為GLY Ⅰ、GLY Ⅱ與GLY Ⅲ。由上可知，XOS對(duì)黑豆子葉組織的外源誘導(dǎo)刺激作用能夠?qū)е伦尤~組織合成和積累次生代謝產(chǎn)物GLYs，同時(shí)GLYs 的誘導(dǎo)合成也是子葉組織細(xì)胞對(duì)XOS 刺激作出的防御性反應(yīng)中的一部分。

圖1 低聚木糖誘導(dǎo)子葉組織中大豆抗毒素的合成確認(rèn)Fig.1 Confirmation of the glyceollins synthesis from XOS-induced soybean cotyledon tissue

2.2 不同產(chǎn)地黑豆子葉中GLYs含量的分析

在XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL-1與誘導(dǎo)時(shí)間3 d條件下，比較3個(gè)產(chǎn)地黑豆中GLYs誘導(dǎo)合成量，結(jié)果（圖2）顯示，臨沂產(chǎn)大粒黑豆、濟(jì)寧產(chǎn)大粒黑豆與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆中GLYs 累積量分別為1.425 2、0.973 2、0.899 0 mg·g-1DW。其中，濟(jì)寧產(chǎn)大粒與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆子葉中GLYs累積量顯著低于臨沂產(chǎn)大粒黑豆，而濟(jì)寧產(chǎn)大粒與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆間無顯著差異。由上可得，臨沂產(chǎn)大粒黑豆更適用于后續(xù)GLYs 誘導(dǎo)合成條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 3個(gè)產(chǎn)地黑豆子葉中GLYs的誘導(dǎo)合成量Fig.2 Synthesized GLYs content from three origins of black soybean under induction

2.3 GLYs合成條件的優(yōu)化

分別考察誘導(dǎo)時(shí)間、XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度及培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs 誘導(dǎo)合成量的影響，篩選誘導(dǎo)時(shí)間、XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度及培養(yǎng)溫度單因素的水平范圍。由圖3 可知，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為2 d 時(shí)，GLYs 累積量達(dá)到較高水平，此后隨著時(shí)間的延長累積量增加不明顯；當(dāng)XOS質(zhì)量濃度為4.0 g·100 mL-1，培養(yǎng)溫度為25 ℃，在誘導(dǎo)時(shí)間2～6 d下的GLYs累積量差異不顯著（P＞0.05），故誘導(dǎo)時(shí)間選擇2～6 d；當(dāng)XOS 誘導(dǎo)質(zhì)量濃度在2.0～8.0 g·100 mL-1時(shí)，GLYs累積量發(fā)生明顯變化，而當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間與培養(yǎng)溫度一定時(shí)，誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為4.0 g·100 mL-1時(shí)合成GLYs 量顯著高于8.0%時(shí)的累積量（P＜0.05），與7.0%時(shí)的累積量差異不顯著（P＞0.05），考慮到GLYs積累量及XOS 誘導(dǎo)質(zhì)量用量，故誘導(dǎo)質(zhì)量濃度選擇在2.0～6.0 g·100 mL-1；當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)質(zhì)量濃度一定時(shí)，培養(yǎng)溫度25 ℃下的GLYs累積量顯著高于其他培養(yǎng)溫度（P＜0.05），17～33 ℃范圍的GLYs含量發(fā)生明顯變化，故選擇此培養(yǎng)溫度范圍。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，誘導(dǎo)時(shí)間2～6 d、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度2.0～6.0 g·100 mL-1及培養(yǎng)溫度17～33 ℃為中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行的單因素水平范圍。

圖3 不同因素下臨沂大粒黑豆中大豆抗毒素的誘導(dǎo)合成量Fig.3 Synthesized GLYs contents from LL under induction of different factors

2.4 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)的分析

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用三因素五水平的CCD-RSM 試驗(yàn)優(yōu)化GLYs 合成的誘導(dǎo)條件。表3 為CCD-RSM 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及GLYs 含量結(jié)果。應(yīng)用Design-Expert 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得二次多項(xiàng)回歸方程如下。

表3 誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)濃度和培養(yǎng)溫度的中心組合設(shè)計(jì)及GLYs含量Table 3 CCD of induction time，XOS concentration and temperature and the GLYs content

式中，Y為GLYs 累積量（mg·g-1DW），X1為誘導(dǎo)時(shí)間（d），X2為誘導(dǎo)質(zhì)量濃度（g·100 mL-1），X3為培養(yǎng)溫度（℃），回歸系數(shù)R2=0.925 4，表明模型擬合較好。

GLYs 合成的優(yōu)化條件為誘導(dǎo)時(shí)間4.03 d、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.08 g·100 mL-1、培養(yǎng)溫度23.83 ℃，此時(shí)GLYs累積量為1.411 8 mg·g-1DW。對(duì)建立的模型進(jìn)行方差分析（表4），F(xiàn)值為13.78（P=0.000 2），表明模型適合度達(dá)到顯著水平；響應(yīng)面試驗(yàn)的誤差較小（失擬項(xiàng)F=0.67，P=0.665 0）；培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs合成累積量影響極顯著，誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度對(duì)GLYs合成累積量影響不顯著；各因素間交互作用不顯著；各因素對(duì)GLYs累積量的影響呈現(xiàn)二次曲線關(guān)系（P＜0.001）；且培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs合成累積量的影響較大，其次為誘導(dǎo)質(zhì)量濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。綜上所述，此模型可用于預(yù)測GLYs的合成累積量。

表4 誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目尚哦萒able 4 Credibility for CCD model of induction time，XOS concentration and temperature

模型誤差統(tǒng)計(jì)分析可用于評(píng)價(jià)其精密度、精確度及可信度。本研究預(yù)測相關(guān)系數(shù)（predictedR-squares，PredR2）和調(diào)整相關(guān)系數(shù)（adjustedRsquares，AdjR2）分別為0.706 9 與0.858 3，二者接近，顯示GLYs 的擬合過程有效；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為11.02%，顯示建立的模型具有較高的精確度與可信度；模型的信噪比（Adeq precision）為11.427（＞4）,顯示建立的模型有較高的精密度。由此表明，回歸模型有良好的預(yù)測性。Design-Expert軟件分析（圖4）表明，殘差的正態(tài)概率分布和預(yù)測值與實(shí)際值分布均處于一條直線，殘差與預(yù)測值分布較為分散，顯示擬合模型具有較好的適應(yīng)性。

圖4 擬合模型的適應(yīng)性分析Fig.4 Adaptability analysis of the fitting model

圖5 是以誘導(dǎo)時(shí)間、XOS 誘導(dǎo)質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度三因素交互效應(yīng)的3D 曲面圖和等高線圖。當(dāng)以培養(yǎng)溫度為中心點(diǎn)時(shí)，GLYs累積量隨著誘導(dǎo)時(shí)間從2～4 d 先增加后降低；誘導(dǎo)質(zhì)量濃度在2.0～4.0 g·100 mL-1時(shí)明顯增加，之后隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸減少；曲線走勢顯示誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的3D 曲面上升幅度比誘導(dǎo)時(shí)間的曲面上升稍明顯（圖5A），表明在研究誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)質(zhì)量濃度交互效應(yīng)時(shí)，誘導(dǎo)質(zhì)量濃度對(duì)GLYs 累積量影響更為明顯；誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的等高線變化比誘導(dǎo)時(shí)間明顯（圖5B）。當(dāng)以誘導(dǎo)時(shí)間為中心點(diǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面3D 曲面的升高幅度比誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的曲面上升幅度大（圖5C）；培養(yǎng)溫度的等高線變化比誘導(dǎo)質(zhì)量濃度明顯（圖5D）。當(dāng)以誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為中心點(diǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面3D曲面的升高幅度比誘導(dǎo)質(zhì)量時(shí)間的曲面上升幅度大（圖5E）；培養(yǎng)溫度的等高線變化比誘導(dǎo)時(shí)間明顯（圖5F）。綜上，培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs 累積量影響顯著。

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間、XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度交互效應(yīng)對(duì)GLYs累積量的等高線圖和曲面圖Fig.5 Contour and response surface plots for the interactive effects of induction time，XOS mass concentration

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

在XOS 誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL-1與誘導(dǎo)時(shí)間3 d 條件下，臨沂產(chǎn)大粒黑豆誘導(dǎo)獲得的GLYs 累積量顯著高于濟(jì)寧產(chǎn)大粒與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆（P＜0.05）。為了驗(yàn)證大豆抗毒素預(yù)測值的優(yōu)化條件，在獲得的優(yōu)化條件（誘導(dǎo)時(shí)間4.03 d、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.08 g·100 mL-1、培養(yǎng)溫度23.83 ℃）下，選擇臨沂大粒黑豆材料開展驗(yàn)證工作。為滿足驗(yàn)證試驗(yàn)的可操作性，驗(yàn)證條件設(shè)為誘導(dǎo)時(shí)間4 d、低聚木糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4 g·100 mL-1、培養(yǎng)溫度24 ℃。在3次重復(fù)試驗(yàn)中，GLYs誘導(dǎo)合成量達(dá)到 1.376 5 mg·g-1DW，與理論 預(yù)測值1.411 8 mg·g-1DW 的相對(duì)誤差為2.5%，表明響應(yīng)面模型與實(shí)際合成量擬合良好，中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)獲得的模型有較好的預(yù)測性。

3 討論

大豆抗毒素具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗雌激素、代謝調(diào)節(jié)、藥物遞送、成骨、神經(jīng)和心血管保護(hù)等多種功效，在醫(yī)藥、保健品、化妝品等領(lǐng)域顯示出巨大的潛在應(yīng)用前景，因此，其獲取途徑受到極大關(guān)注。由于化學(xué)合成方法尚未成熟[21-22]，自然狀態(tài)下健康豆科植物中GLYs 含量又極低或不存在，因此，采用誘導(dǎo)子外源誘導(dǎo)合成成為大豆抗毒素的主要來源。

目前，細(xì)菌、真菌及其細(xì)胞壁提取物或代謝產(chǎn)物、重金屬離子等被用作誘導(dǎo)子誘導(dǎo)豆類獲取GLYs，但這些誘導(dǎo)子存在安全隱患，因此，以功能性寡糖作為誘導(dǎo)子誘導(dǎo)合成被認(rèn)為是安全健康的獲得方式。董向艷等[23]發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶2 種酶單一水解甘薯渣制備的纖維寡糖、果膠寡糖誘導(dǎo)大豆生成的GLYs 量分別為0.80、0.46 mg·g-1DW，而這2種酶聯(lián)合水解甘薯渣產(chǎn)生的復(fù)合寡糖誘導(dǎo)生成的GLYs 量最高可達(dá)1.21 mg·g-1DW。胡佳等[19]通過探究褐藻酸寡糖誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生GLYs的最優(yōu)條件和累積變化，以外在因素對(duì)GLYs 合成的影響展開，得出大豆中GLYs 合成量最高為0.525 mg·g-1FW。張迷敏等[24]探究褐藻酸寡糖誘導(dǎo)大豆合成累積GLYs 過程中的大豆?fàn)I養(yǎng)成分變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，與未處理時(shí)的0.01 mg·g-1GLYs相比，誘導(dǎo)第5天時(shí)GLYs累積量最高為1.72 mg·g-1DW。Peng 等[25]考察了不同分子量及不同古洛糖醛酸（G）∕甘露糖醛酸（M）值的褐藻酸寡糖的GLYs 誘導(dǎo)活性，得到4種褐藻酸寡糖片段△G、△MG、△GMG 及△MGGG 為誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的GLYs 累積量為1.233 9、0.347 2、0.649 4、1.061 1 mg·g-1DW。由此表明，不同來源的功能性寡糖在一定程度上均能誘導(dǎo)大豆生成GLYs，但存在差異，表明篩選功能性寡糖來源具有重要研究意義。

為了快速提高大豆抗毒素合成量或開發(fā)功能豆類產(chǎn)品，本研究以大豆抗毒素誘導(dǎo)合成條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，初步得到誘導(dǎo)累積量的最優(yōu)條件：XOS 誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL-1、培養(yǎng)溫度25 ℃下誘導(dǎo)4 d。外在因素對(duì)低聚木糖誘導(dǎo)大豆抗毒素生成有一定影響，隨著誘導(dǎo)時(shí)間、XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度與培養(yǎng)溫度超過最佳條件GLYs累積量均出現(xiàn)下降，這可能是由于誘導(dǎo)時(shí)間延長會(huì)滋生微生物，而增加誘導(dǎo)質(zhì)量濃度會(huì)損傷細(xì)胞生命活力，過高的培養(yǎng)溫度會(huì)抑制酶的催化活性[26]，從而導(dǎo)致GLYs 合成逐漸受阻至累積量下降。以單因素試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件作為中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，采用Design-Expert軟件對(duì)有限次數(shù)的試驗(yàn)進(jìn)行擬合，建立預(yù)測大豆抗毒素響應(yīng)值的模型且獲得優(yōu)化條件：XOS 誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.08 g·100 mL-1、誘導(dǎo)時(shí)間4.03 d、培養(yǎng)溫度23.83 ℃；且驗(yàn)證試驗(yàn)表明采用優(yōu)化條件時(shí)，大豆抗毒素實(shí)際誘導(dǎo)累積量符合響應(yīng)面模型的預(yù)測。由此表明，該方法合理可行，為大豆抗毒素制備及功能產(chǎn)品開發(fā)提供了理論依據(jù)。