前導(dǎo)肽區(qū)域N-糖基化影響駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和熱穩(wěn)定性研究

王楠，楊彩峰，彭華康，郭文芳，王夢琪，李剛強(qiáng)，劉德虎

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

凝乳酶（chymosin）是一種天冬氨酸蛋白酶，來源于未斷奶哺乳動(dòng)物的胃黏膜細(xì)胞，它可以切割κ-酪蛋白中Phe105和Met106之間的肽鍵，使奶中的酪蛋白析出，形成固態(tài)[1]。凝乳酶是奶酪工業(yè)生產(chǎn)中的重要酶制劑，但通過宰殺哺乳動(dòng)物幼崽獲取凝乳酶的成本極高，因此，采用微生物重組表達(dá)的方法是制備動(dòng)物凝乳酶的主要方式[2]。重組牛凝乳酶是目前奶酪生產(chǎn)用酶的主要來源。近年研究發(fā)現(xiàn)，駱駝來源的凝乳酶對牛乳具有更高的凝乳活性、切割特異性和熱穩(wěn)定性[3-4]，在降低奶酪的生產(chǎn)和儲(chǔ)運(yùn)成本、提升奶酪風(fēng)味方面更具優(yōu)勢。此外，由于不同動(dòng)物來源的酪蛋白結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致牛凝乳酶對駱駝奶無活性，而駱駝凝乳酶可以高效凝固牛奶[3]，因此，駱駝凝乳酶具有更加廣闊的應(yīng)用前景。畢赤酵母具有遺傳操作簡單、生長速度快、適應(yīng)高密度發(fā)酵以及對人畜無害等諸多優(yōu)勢，是工業(yè)中常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[5]。2016年，駱駝凝乳酶已成功在畢赤酵母中重組表達(dá)[6]，但發(fā)酵液表達(dá)量較低，僅為37 mg·L-1，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。本文嘗試通過對駱駝凝乳酶原蛋白進(jìn)行N-糖基化修飾，以提高其在畢赤酵母中的表達(dá)量，進(jìn)而為降低駱駝凝乳酶的生產(chǎn)成本、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供新的研究思路。

N-糖基化是真核生物最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一[7]，糖蛋白上的N-糖基化位點(diǎn)是保守的，N-寡糖鏈特異性的結(jié)合到新合成多肽的N-糖基化結(jié)合位點(diǎn)（Asn-Xxx-Ser∕Thr，Xxx 不能為Pro）的Asn上[7]。N-糖基化能夠顯著地影響蛋白在真核宿主中的表達(dá)水平，李劍鳳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白吸血蝙蝠纖溶酶原激活劑α1（DSPAα1）分子的第117 和第362 位的N-糖基化對其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)具有重要作用，去糖基化突變體N117Q和N362Q的表達(dá)量顯著下降；Tian等[9]使用N-糖基化抑制劑衣霉素處理重組表達(dá)乙酰木聚糖酯酶（分子中含有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)）的畢赤酵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乙酰木聚糖酯酶的分泌表達(dá)量下降18%。銅綠假單胞菌彈性蛋白酶（Psendomonas aeruginosaelastinase,PAE）前導(dǎo)肽的第51 位和第93 位增加N-糖基化位點(diǎn)能夠提高表達(dá)量，而第11 和第127位添加N-糖基化位點(diǎn)則降低表達(dá)量[10]。人尿激酶原[11]和牛腸激酶[12]的N-糖基化對其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)水平?jīng)]有影響。盡管已有許多實(shí)例證實(shí)N-糖基化可以影響蛋白表達(dá)量，但對于不同的蛋白，這種影響的表現(xiàn)不同，其中的分子機(jī)制尚沒有清晰而統(tǒng)一的解釋。N-糖基化除了影響蛋白的表達(dá)量以外，對蛋白自身的分子特性也會(huì)產(chǎn)生影響，包括酶活和熱穩(wěn)定性等。例如，重組表達(dá)的纖維二糖水解酶，將酶蛋白分子活性位點(diǎn)上的N-糖基化去掉，可以提高酶活[13]。華根霉來源的脂肪酶分子的N-糖基化對其溫度穩(wěn)定性具有顯著的影響[14]。綜上，N-糖基化對糖蛋白分子的活性、熱穩(wěn)定性和表達(dá)量都可能產(chǎn)生影響。

駱駝凝乳酶原蛋白分子含有365個(gè)氨基酸，其中N 端42 個(gè)氨基酸是前導(dǎo)肽，前導(dǎo)肽具有自我切割活性[3]。含有前導(dǎo)肽的凝乳酶原全長分子沒有活性，只有在前導(dǎo)肽完成自我切割后，產(chǎn)生的成熟凝乳酶才具有凝乳活性[3,6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，成熟肽直接在酵母中重組表達(dá)沒有活性，且已報(bào)道的重組凝乳酶也均為含有前導(dǎo)肽的酶原形式[3,15-17]，可見，前導(dǎo)肽對凝乳酶重組表達(dá)是必需的。成熟的駱駝凝乳酶蛋白序列中含有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（142N和333N），導(dǎo)致酵母重組表達(dá)的凝乳酶原在SDS-PAGE 或Western-blot 檢測時(shí)，常以2種相近的分子量形式出現(xiàn)，較低分子量為無糖基化形式，較高分子量為低糖基化形式[3,6]。

本研究擬采用N-糖基化的方法，提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的表達(dá)量。由于凝乳酶活性的發(fā)揮需要前導(dǎo)肽的自我切除，因此，本研究選擇在前導(dǎo)肽區(qū)域進(jìn)行N-糖基化突變，既可以對表達(dá)量產(chǎn)生影響，又不改變成熟蛋白氨基酸序列，因此不影響酶活，以期為提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的表達(dá)量提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌克隆載體pEASY-T、Trans10 感受態(tài)細(xì)胞以及cDNA 合成試劑盒、Green qPCR SuperMix 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K、畢赤酵母表達(dá)菌株GS115 和Bis-Tris 4～12%Gel 購自Invitrogen（美國）；各種限制性內(nèi)切酶和糖苷內(nèi)切酶PNGase F 購自NEB（美國）；DNA 無縫連接試劑盒購自中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司；DNA、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和凝乳酶原兔多克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的兔二抗購自Abcam（美國）；脫脂奶粉購自Sigma（美國）；酵母總RNA 提取試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 駱駝凝乳酶原N-糖基化突變體基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 駱駝凝乳酶原N-糖基化突變體基因的構(gòu)建 根據(jù)駱駝凝乳酶原基因Chy序列（GenBank：AJ131677.1）設(shè)計(jì)突變體基因擴(kuò)增引物（表1）。本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建了含有野生型駱駝凝乳酶原（wild）基因的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒載體（wild-9K）[6]。本研究共構(gòu)建6 種N-糖基化突變體基因，其中突變體chy11基因的構(gòu)建方法為：首先以質(zhì)粒載體wild-9K 為模板，以chy11-F 和chy-R 為引物，PCR擴(kuò)增第11 位突變的基因片段（引物chy11-F 中帶有突變位點(diǎn)），再以該P(yáng)CR 產(chǎn)物為模板，以chy-F和chy-R 為引物，PCR 擴(kuò)增突變體chy11全長基因。突變體chy26基因的構(gòu)建方法為：以質(zhì)粒載體wild-9K 為模板，以chy26-2F 和chy-R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（引物chy26-2F 中帶有突變位點(diǎn)），再以該P(yáng)CR 產(chǎn)物為模板，以chy26-1F 和chy-R 為引物，進(jìn)行第2輪PCR 擴(kuò)增，然后以該擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以chy-F 和chy-R 為引物，進(jìn)行第3 輪PCR 擴(kuò)增，獲得突變體chy26全長基因。突變體chy34基因的擴(kuò)增方法為：首先以wild-9K 為模板，以chy34-F 和chy-R 為引物，PCR 擴(kuò)增得 到含有 第34 位突變位點(diǎn)的3’端部分基因片段，同時(shí)，以wild-9K 為模板，以chy-F 和chy34-R 為引物，PCR擴(kuò)增得到含有第34 位突變位點(diǎn)的5’端部分基因片段，再以上述兩端PCR 產(chǎn)物等比例混合物為模板，以chy-F 和chy-R 為引物，PCR 擴(kuò)增，獲得突變體chy34 全長基因。突變體chy35、chy38和chy39的構(gòu)建方法同chy34。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 含突變體基因的表達(dá)載體的構(gòu)建 引物chy-F和chy-R的5’端含有pPIC9K表達(dá)載體NotⅠ位點(diǎn)處的同源序列，采用DNA 無縫連接試劑盒將上述6種突變體基因的PCR產(chǎn)物分別與NotⅠ酶切的pPIC9K 進(jìn)行重組連接，獲得6 種含突變體基因的表達(dá)載體（mchy-9K）。突變基因位于α 因子分泌信號(hào)肽和AOX1終止子之間，形成完整的AOX1啟動(dòng)子-分泌信號(hào)肽-突變基因-AOX1終止子表達(dá)框。載體DNA 經(jīng)測序驗(yàn)證基因已發(fā)生突變，DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

野生型和突變體凝乳酶原表達(dá)載體分別用SalⅠ線性化，采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115 菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。電擊儀為Bio-Rad Micropulser Electroporater (Bio-Rad,美國)，主要參數(shù)設(shè)置為：電壓1 500 V，電阻200 Ω，電容50μF[感受態(tài)制備方法和電轉(zhuǎn)方法參照Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen）操作說明書]。轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)涂布于含有0.5 mg·mL-1G418 的YPD 固體培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1.5%瓊脂）平板上，28°C靜置培養(yǎng)3～5 d至陽性克隆出現(xiàn)。將陽性克隆分別挑取至含有0.4 mg·mL-1G418的10 mL BMGY液體培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、4%甘油）中，28°C、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h，至OD600約為2.0。發(fā)酵液10 000 r·min-1離心5 min收集菌體，將菌體重懸于含有0.4 mg·mL-1G418的10 mL BMMY（1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇）液體培養(yǎng)基中，28°C、200 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)期間每間隔24 h補(bǔ)加0.5%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇。發(fā)酵液10 000 r·min-1離心5 min收集上清，采用Western-blot 方法[18]對發(fā)酵液上清中凝乳酶原蛋白進(jìn)行定性鑒定，采用ELISA方法[19]對表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析。

1.4 駱駝凝乳酶原基因熒光定量PCR

在比較各凝乳酶原突變體在畢赤酵母中的表達(dá)量之前，為確定表達(dá)量的差異來源于N-糖基化而非基因拷貝數(shù)的差異，首先采用相同的轉(zhuǎn)化方法和相同的G418濃度，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。然后采用熒光定量PCR 的方法對轉(zhuǎn)化子中凝乳酶原突變體基因的mRNA進(jìn)行測定和比較分析。具體方法如下：取2 mL 的0.5%甲醇誘導(dǎo)24 h 的發(fā)酵液（含0.4 mg·mL-1G418 的BMMY 液體培養(yǎng)基），12 000 r·min-1離心1 min，收集菌體。采用酵母總RNA 提取試劑盒提取總RNA，cDNA 合成試劑盒進(jìn)行cDNA 的合成，以cDNA 為模板，內(nèi)參基因?yàn)閍ctin，以qPCR-F∕R 和actin-F∕R 為引物（表1），利用Green qPCR SuperMix 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，熒光定量PCR 儀為QuantStudio 3 instrument(Thermo Fisher Scientific,美國)。

1.5 重組駱駝凝乳酶原的活性和溫度穩(wěn)定性測定

為測定前導(dǎo)肽區(qū)域突變后是否影響其自切割活性，將重組蛋白的發(fā)酵液上清進(jìn)行酸-中和處理后，測定凝乳活性。凝乳活性測定的底物制備方法為：用10 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液（pH5.5）配制26%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）脫脂奶粉作為底物。凝乳酶原采用酸-中和處理進(jìn)行活化，具體方法為：野生型和突變體的酵母表達(dá)菌株經(jīng)0.5%甲醇誘導(dǎo)72 h 后，12 000 r·min-1離心1 min，收集發(fā)酵液上清；將發(fā)酵液上清用1 mol·L-1HCl調(diào)pH至2.0，25 ℃靜置2 h，使前導(dǎo)肽在酸性條件下進(jìn)行自我切割，再用1 mol·L-1NaOH 調(diào)pH 至5.5，即為活化后的酶液。取490 μL 底物與10 μL 酶液于2 mL 離心管中，37 ℃緩慢震蕩5 min，如此時(shí)乳液凝固，即成熟肽發(fā)揮了凝乳活性，表明前導(dǎo)肽具有自我切割活性。溫度穩(wěn)定性測定是將發(fā)酵液上清在梯度溫度（25～65 ℃）下靜置8 h 后，測定其殘余相對凝乳活力，最終確定凝乳酶的溫度穩(wěn)定性[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種突變體駱駝凝乳酶原N-糖基化突變位點(diǎn)分析

借助前導(dǎo)肽原始蛋白序列中既有的Ser 或Thr，將其-2 位置氨基酸突變?yōu)锳sn，在僅改變1 個(gè)氨基酸的情況下，構(gòu)建成N-糖基化的保守序列Asn-Xxx-Ser∕Thr，目的是盡量減少對原始序列的改變，從而減少對前導(dǎo)肽自切割活性的影響。另外，Asp 的分子結(jié)構(gòu)與Asn 相近，將第26 位的Asp突變?yōu)锳sn，同時(shí)將第28 位的Leu 突變?yōu)門hr，形成1 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，以增加糖基化位置的多樣性。6種突變體的N-糖基化位點(diǎn)如圖1所示，根據(jù)N-寡糖鏈連接到蛋白序列上的位置，分別命名為：chy11、chy26、chy34、chy35、chy38和chy39，對應(yīng)的氨基酸突變位點(diǎn)分別為：G11N、D26N∕L28T、A34N、V35N、K38N 和Y39N，突變后的位點(diǎn)均形成了N-糖基化保守序列。將突變體基因構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體中，經(jīng)DNA 測序，證明突變表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 駱駝凝乳酶前導(dǎo)肽的N-糖基化突變位點(diǎn)Fig.1 Mutant sites of N-glycosylation in the propeptide of prochymosin.

2.2 N-糖基化對駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中分泌表達(dá)水平的影響

2.2.1 駱駝凝乳酶原糖基化分析 經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，對發(fā)酵液上清進(jìn)行Western-blot 鑒定，結(jié)果（圖2）顯示，所有的突變體均能夠在GS115 中分泌表達(dá)（圖2A），與野生型相比，突變體chy11、chy26與野生型的蛋白分子量差異不大，均為2條帶，分子量較大的條帶為低糖基化形式，分子量約為45 kD；較小的為無糖基化形式，分子量約為40 kD。突變體chy34、chy35、chy38和chy39的蛋白分子量達(dá)到70 kD 左右，且條帶呈彌散狀，為過度糖基化（hyper-glycosylated）形式的典型帶形。野生型和所有突變體均用糖苷酶PNGase F去糖基化處理后，分子量均下降至40 kD（圖2B），表明突變體分子量和帶形的差異均來自N-糖基化。

圖2 野生型和突變體凝乳酶原Western-blot分析Fig.2 Western-blot analysis of wild and mutant prochymosins

2.2.2 駱駝凝乳酶原分泌表達(dá)量分析 對突變體的相對分泌表達(dá)量（圖3）分析表明，與野生型相比，突變體chy34、chy35、chy38和chy39的分泌水平顯著提高，其中chy34的分泌水平最高。

圖3 發(fā)酵液上清中野生型和突變體凝乳酶原的相對分泌表達(dá)量比較Fig.3 Secretion level comparison of wild and mutant prochymosins by western-blot

同時(shí)，采用熒光定量PCR 法測定和比較了重組酵母中野生型和突變體基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果（圖4）顯示，野生型和突變體chy11、chy35、chy39的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異，與chy26、chy34、chy38在P＜0.05 水平上有顯著差異，但差異較小，均不超過1.4 倍。與圖3 相對比可知，mRNA 水平與表達(dá)水平無相關(guān)性，即表達(dá)量的差異不是來源于基因拷貝數(shù)以及轉(zhuǎn)錄水平的差異，而是糖基化的差異。

圖4 熒光定量PCR比較凝乳酶原基因的相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 qPCR analysis of the relative mRNA levels of the prochymosin genes

2.3 N-糖基化對駱駝凝乳酶原前導(dǎo)肽自切割活性的影響

如圖5 所示，所有的突變體均表現(xiàn)出凝乳活性（陰性對照為空菌株GS115 的發(fā)酵液上清經(jīng)過同樣的酸-中和處理后的活性測定），表明6 種N-糖基化突變均不影響前導(dǎo)肽的自切割活性。

圖5 凝乳酶原前導(dǎo)肽的自切割活性分析Fig.5 Analysis of autocatalytic cleavage of the propeptide by confirming the milk-clotting acitity

2.4 N-糖基化對駱駝凝乳酶原熱穩(wěn)定性的影響

N-糖基化除了影響凝乳酶的表達(dá)水平外，還可能影響其溫度穩(wěn)定性。通過測定凝乳酶相對剩余酶活比較了野生型和6 種突變體的溫度穩(wěn)定性。與野生型相比，6 種突變體的溫度穩(wěn)定性均有不同程度的提高（圖6）。野生型和突變體在25 ℃保溫8 h 后，凝乳活性均沒有變化；當(dāng)溫度升高至45 ℃時(shí)，野生型相對酶活下降至50%，而6種突變體的活性仍保持100%；當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，野生型的酶活完全喪失，突變體仍有20%～80%的相對酶活；當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，所有突變體的相對酶活均喪失。上述結(jié)果表明，前導(dǎo)肽區(qū)域6種不同位置的N-糖基化突變，均可以提高凝乳酶原的溫度穩(wěn)定性。

圖6 野生型和突變體凝乳酶原的熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of thermostability of wild and mutant prochymosins

3 討論

研究表明，N-糖基化對不同的外源蛋白在真核宿主中的表達(dá)量會(huì)產(chǎn)生不同的影響。即使是同種外源蛋白，不同的N-糖基化位置，也會(huì)產(chǎn)生不同的影響。例如，DSPAα1 分子的N-糖基化會(huì)提高其在畢赤酵母中的表達(dá)量[8]，而彈性蛋白酶PAE 的N-糖基化對表達(dá)量的影響與糖基化的位置有關(guān)[10]。目前關(guān)于N-糖基化影響蛋白表達(dá)量的分子機(jī)制尚未得到明確的解析，無法預(yù)測N-糖基化對表達(dá)量的影響方式。本研究為提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的表達(dá)量，構(gòu)建了在前導(dǎo)肽6 個(gè)不同位置添加N-糖基化位點(diǎn)的突變體，發(fā)現(xiàn)其中4 個(gè)位點(diǎn)（第34 位、第35 位、第38 位、第39 位）能夠顯著提高表達(dá)量，表明采用N-糖基化的方法可以提高駱駝凝乳酶原的表達(dá)量，且N-糖基化的位置起著關(guān)鍵作用。

在6 種N-糖基化突變體中，chy11和chy26的分子量與野生型差別不大，只是低糖基化的比例有所提高，它們的分泌表達(dá)量提升不顯著。突變體chy34、chy35、chy38、chy39的分子量顯著增加，表明這4 個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生了過度糖基化，過度糖基化是糖蛋白進(jìn)入高爾基體后寡糖鏈被進(jìn)一步加長導(dǎo)致的[20]，這些蛋白條帶呈現(xiàn)彌散狀，主要是由于過度糖基化寡糖鏈的糖不均一性[21]以及寡糖鏈與蛋白結(jié)合后，改變了蛋白質(zhì)與SDS 的結(jié)合[22]，進(jìn)而改變蛋白在凝膠中的遷移行為所引起的。同時(shí)，它們的分泌表達(dá)量也顯著提高。其中突變體chy34表達(dá)量最高。由此可見，特定位點(diǎn)的N-糖基化是提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中分泌表達(dá)水平的有效方法。

本研究中，盡管突變體chy34、chy35、chy38和chy39的表達(dá)量顯著提高，但凝乳酶原只有在前導(dǎo)肽完成自我切割后，才能發(fā)揮凝乳活性，因此，在N-糖基化突變后，前導(dǎo)肽仍能保持自切割活性是其工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。活性測定結(jié)果表明，所有的突變均不影響前導(dǎo)肽的自切割。這可能歸功于每種突變體均只突變了1～2 個(gè)氨基酸位點(diǎn)，盡量減少對前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)的影響，另外，也可能是前導(dǎo)肽本身與成熟凝乳酶相互作用的自由度較大，個(gè)別氨基酸的突變不影響兩者的相互作用，也不影響凝乳酶原的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。前導(dǎo)肽區(qū)域的N-糖基化突變不僅提高了凝乳酶原的分泌表達(dá)量，而且不影響活性，因此，在相同的發(fā)酵條件下，駱駝凝乳酶原的生產(chǎn)成本也將會(huì)降低，有利于工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。

溫度穩(wěn)定性也是凝乳酶生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)的重要影響因素。已有許多報(bào)道顯示，N-糖基化能夠影響糖蛋白的溫度穩(wěn)定性[21,23-24]，本研究發(fā)現(xiàn)，N-糖基化能夠顯著提高蛋白的熱穩(wěn)定性，即使chy11和chy26突變體的分泌表達(dá)量提高的并不顯著，但它們的溫度穩(wěn)定性也比野生型有了顯著的提高。這種N-糖基化對溫度穩(wěn)定性的積極作用，可能是由于糖鏈能夠增加附近氨基酸的結(jié)構(gòu)剛性，使其更不易變性[25]。同時(shí)，糖鏈?zhǔn)怯H水性的大分子，糖鏈的存在使蛋白在水溶液中更加不易于形成沉淀。另外，Dalit 等[26]報(bào)道了糖鏈對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響的關(guān)鍵在于糖鏈的位置，而不是糖鏈的長度，本研究也驗(yàn)證了這一假說，即突變體chy11和chy26為低糖基化形式，而chy34、chy35、chy38和chy39為過度糖基化形式，但這些糖基化都對溫度穩(wěn)定性產(chǎn)生了顯著的影響。

綜上所述，駱駝凝乳酶原前導(dǎo)肽特定位點(diǎn)的N-糖基化，能夠顯著提高其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)水平和溫度穩(wěn)定性，且不影響前導(dǎo)肽的自我切割。本研究為降低重組駱駝凝乳酶的工業(yè)生產(chǎn)成本，擴(kuò)大畢赤酵母的應(yīng)用范圍提供了研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為闡釋N-糖基化影響糖蛋白表達(dá)的分子機(jī)制提供了新的參考。