不同賴(lài)氨酸水平對(duì)熊蜂幼年工蜂發(fā)育及代謝影響

郝冬梅，樊瑩，徐進(jìn)，郭岳琴，李繼蓮，姚軍*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴陽(yáng) 550001）

地熊蜂（Bombus terrestris）屬于蜜蜂總科（Apidae）熊蜂屬（Bombus），其不僅采集能力強(qiáng)[1]，而且環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，具有耐熱、耐濕、耐寒、可規(guī)模化飼養(yǎng)和易運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)[2-3]，已大規(guī)模的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)授粉中。地熊蜂的生長(zhǎng)發(fā)育有卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蜂4 個(gè)階段，其中，幼蟲(chóng)和成蜂階段是營(yíng)養(yǎng)攝入的主要階段，此階段提供優(yōu)質(zhì)、充足營(yíng)養(yǎng)的飼料與熊蜂規(guī)?；曫B(yǎng)和后期授粉應(yīng)用關(guān)系密切。在為設(shè)施作物授粉期間，單一作物的花粉很難提供熊蜂生長(zhǎng)發(fā)育所需全部營(yíng)養(yǎng)，適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化則有助于延長(zhǎng)熊蜂的授粉周期。在熊蜂工廠化繁育中，盡管目前人工飼養(yǎng)技術(shù)已逐漸成熟[4]，但為了飼養(yǎng)更強(qiáng)健、授粉周期更長(zhǎng)的蜂群，都會(huì)對(duì)飼料配方進(jìn)行不斷優(yōu)化。蛋白質(zhì)是熊蜂所必需的營(yíng)養(yǎng)，對(duì)成年蜜蜂的免疫應(yīng)答、壽命有積極影響[5-6]。氨基酸是大多數(shù)生物合成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)，對(duì)蜜蜂生長(zhǎng)、發(fā)育起關(guān)鍵作用，影響營(yíng)養(yǎng)需求的平衡，成年蜂的飛行能力、健康和壽命也與其有關(guān)，最終將影響授粉效果。因此了解成年熊蜂的氨基酸需求對(duì)熊蜂規(guī)?；曫B(yǎng)和授粉應(yīng)用都十分重要。

除了參與蛋白質(zhì)合成外，氨基酸在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞信號(hào)、抗氧化反應(yīng)和免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[7]。食物中補(bǔ)充谷氨酰胺或精氨酸可增加小腸與脂肪組織中抗氧化基因的表達(dá)，降低促炎基因的表達(dá)；谷氨酸與天冬氨酸調(diào)節(jié)還原當(dāng)量物通過(guò)線粒體膜的轉(zhuǎn)移，從而調(diào)節(jié)糖酵解和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)；色氨酸通過(guò)吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的分解代謝對(duì)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的免疫功能有著重要作用。

氨基酸在營(yíng)養(yǎng)學(xué)中分為必需氨基酸和非必需氨基酸，其中，生物體內(nèi)無(wú)法自行合成必需氨基酸，必需通過(guò)食物獲得，而蛋白質(zhì)種類(lèi)決定昆蟲(chóng)消化產(chǎn)生必需和非必需氨基酸的比例和類(lèi)型[8-9]，單一種類(lèi)花粉通常不能滿足熊蜂發(fā)育所需的氨基酸。與非必需氨基酸相比，飼喂含有必需氨基酸飼料可增加哺育蜂頭部與覓食蜂胸部重量，通過(guò)頭部與胸部質(zhì)量可反映蜜蜂腺體與肌肉發(fā)育情況[10]，并且蜜蜂對(duì)必需氨基酸的偏好高于非必需氨基酸[11]。研究發(fā)現(xiàn)，向日葵花粉中蛋氨酸與色氨酸含量低，導(dǎo)致使用向日葵花粉飼喂的熊蜂蜂群幼蟲(chóng)重量顯著低于其他花粉組[5,12]，飼喂單一向日葵花粉會(huì)降低工蜂壽命，抑制新出房工蜂咽下腺發(fā)育[13]。Groot[14]通過(guò)籠養(yǎng)試驗(yàn)確定了蜜蜂所需的10 種必需氨基酸。熊蜂對(duì)必需氨基酸的需求與蜜蜂相似，但熊蜂對(duì)氨基酸的需求量鮮有報(bào)道，因此有必要進(jìn)一步深入研究不同氨基酸對(duì)熊蜂發(fā)育的影響。

自然界中，熊蜂一般采集蛋白質(zhì)豐富、氨基酸含量高的混合花粉[15]，氨基酸含量高的花粉可提高熊蜂產(chǎn)卵率與幼蟲(chóng)質(zhì)量[16]。如果飼料中缺乏某種必需氨基酸或氨基酸含量低都會(huì)抑制熊蜂蜂群的發(fā)育。熊蜂飼糧中，必需氨基酸水平過(guò)高會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)增加過(guò)多氮排泄物，從而縮短壽命[17]。

賴(lài)氨酸是蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育必需的，在動(dòng)物體內(nèi)參與酶、血清蛋白、激素等蛋白質(zhì)的合成，對(duì)脂肪代謝、免疫功能方面有著重要作用[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中不同賴(lài)氨酸水平對(duì)肉雞日增重和仔雞血清中白蛋白、總膽固醇尿素氮有著顯著影響[20]。Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，賴(lài)氨酸缺乏導(dǎo)致肉雞體內(nèi)對(duì)新城病毒抗體水平下降。此外，飼糧中添加賴(lài)氨酸可顯著提高單胃型肉用動(dòng)物的肌肉蛋白質(zhì)含量與大菱鲆的粗蛋白含量[22-23]。當(dāng)豬飼料中賴(lài)氨酸水平降低時(shí)，肌內(nèi)脂肪含量增加，腰眼面積減少[24]。對(duì)于蜜蜂，賴(lài)氨酸、色氨酸等氨基酸在蜜蜂生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用，并影響營(yíng)養(yǎng)需求的平衡[25]；Groot[26]研究表明西方蜜蜂對(duì)賴(lài)氨酸的適宜需求量為3%；王帥等[27]推薦意大利蜜蜂幼蟲(chóng)對(duì)賴(lài)氨酸需求量為11.08～16.08 mg·g-1。對(duì)于畜禽養(yǎng)殖，賴(lài)氨酸是谷類(lèi)蛋白質(zhì)的第一限制氨基酸，而對(duì)于熊蜂全價(jià)飼料或氨基酸營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的研發(fā)，谷物是最易于獲取的原料來(lái)源。因此，本研究首選了賴(lài)氨酸作為研究重點(diǎn)。

代謝組學(xué)是研究生物體系代謝途徑的學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分?；诖x組學(xué)分析熊蜂血淋巴的生物標(biāo)志性成分有助于改善熊蜂健康監(jiān)測(cè)和鑒別營(yíng)養(yǎng)壓力來(lái)源[28]。本研究擬通過(guò)飼喂熊蜂含有一定水平賴(lài)氨酸的飼糧，通過(guò)液相色譜∕質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS）檢測(cè)其對(duì)熊蜂工蜂血淋巴代謝的影響，同時(shí)采用主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判別分 析（orthogonal partial leastsquaresdiscriminant analysis,OPLS-DA），篩選對(duì)熊蜂工蜂血淋巴代謝影響的差異代謝物，并結(jié)合代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）探討涉及賴(lài)氨酸代謝的通路，有助于了解賴(lài)氨酸對(duì)熊蜂的生理功能，發(fā)掘?qū)π芊渖L(zhǎng)、發(fā)育和壽命有利的因素。

1 材料與方法

1.1 供試蜂群

供試熊蜂由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所傳粉蜂生物學(xué)與授粉飼養(yǎng)室提供。選擇群勢(shì)相當(dāng)?shù)慕】捣淙海策x取體質(zhì)量相近的1 日齡工蜂140 只，置于同一蜂箱中，隨后從中隨機(jī)選取5 只工蜂組成無(wú)王工蜂群，共28 個(gè)。將28 個(gè)無(wú)王蜂群分為4 組，分別飼喂4 種不同賴(lài)氨酸含量的糖水，每組7個(gè)重復(fù)，溫度為（26±2）℃，相對(duì)濕度為60%±5%，黑暗條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 飼糧配置

供試飼糧為60%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）蔗糖水溶液，含18種氨基酸（賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸），總氨基酸添加量為蔗糖（干質(zhì)量）的3%。除賴(lài)氨酸外，各種氨基酸添加量參照酪蛋白中氨基酸組成添加。所用氨基酸均為L(zhǎng)-型氨基酸，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。賴(lài)氨酸處理設(shè)置4 個(gè)水平，添加量分別占總氨基酸的0%（對(duì)照）、2%、4%、6%。

1.3 飼喂管理

4 組工蜂群分別飼喂4 種不同含量賴(lài)氨酸的飼糧，9:00—10:00 飼喂，飼喂結(jié)束后將瓶中剩余的蔗糖與氨基酸混合液清除掉，并清洗飼喂瓶，每隔3 d 飼喂1 次，注入新熬制的蔗糖與氨基酸混合液。每天觀察微蜂群情況，及時(shí)將死亡的工蜂移除，至20 日齡時(shí)終止飼喂，完成試驗(yàn)蜂群的整個(gè)飼養(yǎng)階段。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 工蜂存活率 在試驗(yàn)期間，每天觀察每組工蜂死亡情況，并記錄死亡數(shù)量。

1.4.2 工蜂肌肉蛋白含量 試驗(yàn)結(jié)束后每個(gè)處理隨機(jī)選取工蜂，稱(chēng)重后取出胸部肌肉，加入0.9%的生理鹽水，使用微型渦旋震蕩器（QL-901，江蘇南海市其林貝爾儀器制造有限公司）勻漿，2 500 r·min-1離心10 min后取上清液。采用總蛋白定量測(cè)試盒（A045-2-2，南京建成生物工程研究所）測(cè)定胸部蛋白含量，每組處理5個(gè)重復(fù)。

1.5 血淋巴代謝物提取和檢測(cè)

1.5.1 樣品采集 無(wú)王蜂群飼養(yǎng)至15 日齡時(shí)，隨機(jī)選取工蜂10 只，選取頭部一端觸角，使用70%乙醇對(duì)觸角周?chē)膮^(qū)域消毒，隨后用鑷子去除該觸角，輕輕按壓工蜂腹部至工蜂觸角部位出現(xiàn)血淋巴，立即用移液槍將其吸出[29]，收集于1.5 mL離心管，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.5.2 代謝物提取和檢測(cè) 利用100%甲醇提取血淋巴中的代謝物，每個(gè)處理組6 個(gè)平行。將凍存的樣品在冰上充分解凍，取10μL 淋巴樣品，加入50μL甲醇，超聲10 min,使樣品充分溶解，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清液于內(nèi)襯管中，置于2 mL棕色進(jìn)樣瓶中供LC-MS分析。

超高效液相色譜系統(tǒng)（Ultimate 3000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）檢測(cè)條件：ACQUITY BEH Amide 色譜柱（Waters，150 mm×2.1 mm，1.7 μm），進(jìn)樣量2 μL，柱溫50 ℃；流動(dòng)相A 為30%乙腈溶液（含0.1%甲酸和10 mmol 甲酸銨），流動(dòng)相B 為95% 乙腈溶液（含0.1% 甲酸和10 mmol 甲酸銨），流速0.3 mL·min-1。梯度洗脫：0.0～1.0 min，100% B；1.1～11.0 min，100%～30%B；11.1～11.5 min，30%～100%B；11.6～15.0 min，100%B。

質(zhì)譜儀（Q-Exactive，美國(guó)Thermo FisherScientific公司）采用HESI離子源，在正、負(fù)離子切換模式下采集。參數(shù)設(shè)置：離子源溫度320 ℃，噴霧電壓正離子3.5 kV 和負(fù)離子3.0 kV，鞘氣體流速40 arb，輔助氣流速5 arb，S-lens 射頻電壓60%，母離子掃描分辨率70 000，掃描范圍70～1 000 m·z-1，自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)1×106，最大離子注入時(shí)間50 ms，掃描速率1 scan·s-1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 蛋白質(zhì)含量統(tǒng)計(jì)分析 工蜂胸部蛋白含量利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）；生存曲線采用Logrank 檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，使用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行圖表的繪制。

1.6.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析 將原始代謝組學(xué)數(shù)據(jù)Raw 文件導(dǎo) 入Compound Discoverer 2.1軟件（Thermo Fisher Scientfic）進(jìn)行離子峰識(shí)別、峰對(duì)齊、峰面積歸一化處理及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，使用KEGG（http:∕∕www.genme.jp∕kegg∕）和HMDB（http:∕∕www.hmdb.ca∕）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物鑒定。隨后采用MetaboAnalyst 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)和富集分析：通過(guò)主成分分析反映處理組間的樣本總體代謝差異；正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial leastsquares-discriminant analysis,OPLS-DA）反映組內(nèi)樣本間的變異度大小；對(duì)OPLS-DA 圖驗(yàn)證模型是否穩(wěn)定和出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力，Q2＞0.5 表示模型具有較好的判別分析能力，Q2與R2越接近說(shuō)明模型越穩(wěn)定且無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象。根據(jù)變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1、P值＜0.05、FC 值＞1.5或FC 值＜1∕1.5篩選差異代謝物，最后進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧賴(lài)氨酸水平對(duì)工蜂胸部肌肉蛋白含量的影響

由圖1 可知，隨著飼糧賴(lài)氨酸水平的增加，20 日齡工蜂胸部肌肉蛋白含量呈上升趨勢(shì)。與飼糧無(wú)賴(lài)氨酸對(duì)照（0%）相比，飼糧賴(lài)氨酸含量4%時(shí)工蜂胸肌肉部蛋白含量顯著升高。當(dāng)賴(lài)氨酸水平提高至6%時(shí)，胸部肌肉蛋白含量顯著高于2%和0%處理組（P＜0.05）。

圖1 不同處理下工蜂胸部肌肉蛋白含量Fig.1 Chest muscle protein content of worker bees under different treatment

2.2 飼糧賴(lài)氨酸對(duì)工蜂死亡數(shù)量的影響

在不同的賴(lài)氨酸添加量飼喂中，熊蜂的存活率不同（χ2=21.70，P＜0.001）。由圖2和表1可以看出，當(dāng)飼料中缺乏賴(lài)氨酸（0%）時(shí)，工蜂存活率最低，賴(lài)氨酸水平為6%時(shí)，工蜂存活率最高，且兩處理間差異極顯著（P＜0.001）；賴(lài)氨酸水平為2%與4%時(shí)，工蜂存活率相近，組間差異不顯著。

表1 不同賴(lài)氨酸水平下工蜂存活率的差異Table 1 Differences in survival rate of workerbees under different lysine levels

圖2 不同賴(lài)氨酸水平下工蜂存活率Fig.2 Survival rate of worker bees under different lysine levels

2.3 工蜂血淋巴代謝組學(xué)分析

2.3.1 主成分分析 對(duì)飼喂賴(lài)氨酸水平為0%與6%的工蜂血淋巴代謝物進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3 所示?？梢钥闯?，0%的賴(lài)氨酸飼喂組與6%飼喂組差異明顯。為了更準(zhǔn)確地顯示2 種賴(lài)氨酸含量對(duì)工蜂血淋巴的代謝物影響，使用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）模型進(jìn)行了深入分析，血淋巴代謝物OPLS-DA 得分如圖4 所示。對(duì)模型進(jìn)行排序驗(yàn)證，參數(shù)為：R2X（cum）=0.725。R2Y（cum）=0.998，Q2（cum）=0.996，Q2＞0.5，且Q2與R2Y相接近，表明模型穩(wěn)定可靠，沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象。

圖3 PCA得分Fig.3 PCA score scatter plot

圖4 OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score scatter plot

2.3.2 差異代謝物的鑒定與分析 如表2 所示，通過(guò)OPLS-DA 分析，根據(jù)VIP＞1、P＜0.05、FC 值＞1.5 或FC 值＜1∕1.5 的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)KEGG、HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共鑒定出28 種差異代謝物，包括氨基酸及其衍生物、嘌呤類(lèi)化合物等，其中，含量上升的物質(zhì)有10 種，下降的物質(zhì)有18 種。哌啶酸、L-酵母氨酸、黃嘌呤上升差異倍數(shù)最為顯著，可能是飼糧中賴(lài)氨酸含量增加導(dǎo)致。而過(guò)量賴(lài)氨酸可能影響其他氨基酸的吸收，如組氨酸等。

表2 差異代謝物Table 2 Differential metabolites

2.3.3 KEGG 富集分析 KEGG 通路富集顯示，28 種差異代謝物富集到了20 條代謝通路（表3），其中，5 條具有顯著差異的富集通路：組氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸生物合成，嘌呤代謝，泛酸和輔酶A生物合成。

表3 KEGG 通路富集詳情T(mén)able 3 Enrichmegnt of KEGG pathway

3 討論

3.1 飼糧賴(lài)氨酸水平對(duì)工蜂生長(zhǎng)的影響

賴(lài)氨酸作為必需氨基酸，其主要作用是參與機(jī)體蛋白質(zhì)合成，如血清蛋白、酶、多肽、激素等。長(zhǎng)期進(jìn)食低賴(lài)氨酸飼料會(huì)降低大鼠體內(nèi)血清球蛋白與β-球蛋白的含量抑制肝臟蛋白質(zhì)的合成，影響大鼠的生長(zhǎng)[30]。當(dāng)飼料中賴(lài)氨酸水平增加時(shí)，大鼠大腦、肝臟和腎的蛋白含量也隨之增加[31]。當(dāng)賴(lài)氨酸水平為6%時(shí)，工蜂胸部肌肉蛋白含量達(dá)到為47.53 mg·mL-1。

工蜂的壽命是衡量熊蜂授粉價(jià)值的重要指標(biāo)，飼糧中不同賴(lài)氨酸水平對(duì)其壽命影響很大，當(dāng)飼糧中賴(lài)氨酸水平為0%時(shí)，工蜂存活率最低，且隨著時(shí)間的增加死亡數(shù)量也在增加。這可能是熊蜂飼糧中缺乏賴(lài)氨酸，導(dǎo)致一些蛋白無(wú)法合成，從而無(wú)法滿足工蜂生長(zhǎng)發(fā)育的需求。當(dāng)賴(lài)氨酸水平增加至2%和4%時(shí)，工蜂死亡數(shù)量減少；當(dāng)賴(lài)氨酸水平增加至6%時(shí)，工蜂僅在前5 日內(nèi)有工蜂死亡，且死亡數(shù)量最少，與其他3 組存活率存在極顯著差異。綜上可知，飼糧中賴(lài)氨酸水平為6%時(shí)，工蜂存活率最高。隨著賴(lài)氨酸水平增加，工蜂生存率隨之上升，這可能與體內(nèi)蛋白質(zhì)含量增加有關(guān)。

3.2 賴(lài)氨酸對(duì)工蜂代謝的影響

在5 條顯著富集通路中，組氨酸代謝為極顯著（P＜0.01）富集通路。有3 種顯著差異代謝物富集到了組氨酸代謝通路中，其中2 種為下調(diào)，包括組胺、尿刊酸，L-天冬氨酸為上調(diào)。在血淋巴代謝物中，組氨酸含量出現(xiàn)下調(diào)（FC=0.80），這可能與賴(lài)氨酸水平過(guò)高有關(guān)。賴(lài)氨酸水平過(guò)高可能會(huì)抑制腸道對(duì)其他氨基酸的消化吸收，從而使其他氨基酸在機(jī)體內(nèi)含量降低。研究發(fā)現(xiàn)，不同賴(lài)氨酸水平飼糧喂食生長(zhǎng)豬，其肝門(mén)靜脈血清中組氨酸含量隨著賴(lài)氨酸水平的增加而降低[32]。組氨酸作為必需氨基酸之一，參與蛋白質(zhì)的合成，是動(dòng)物體血紅蛋白的重要組成部分，其代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、維持機(jī)體健康的作用。在組氨酸代謝途徑中，組氨酸在組氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下產(chǎn)生尿刊酸，參與紫外線引起的免疫抑制作用[33]。組胺由組氨酸脫羧而產(chǎn)生，組胺作為神經(jīng)元與腦部神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[34]。除此之外，組氨酸還可作為中間產(chǎn)物參與谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的合成[35]。

天冬氨酸為非必需氨基酸，但外源性天冬氨酸可緩解三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如草酰乙酸和蘋(píng)果酸的缺失，從而提高ATP的合成[36-37]。α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中心物質(zhì)，參與多條代謝途徑，對(duì)細(xì)胞新陳代謝有著重要作用[38]。本研究結(jié)果顯示，天冬氨酸與α-酮戊二酸顯著富集到精氨酸生物合成與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝兩條途徑中，且這兩種代謝物均顯著（P＜0.05）上調(diào)。精氨酸與賴(lài)氨酸都屬于必需氨基酸，精氨酸為一氧化氮與多種生物活性物質(zhì)合成的前體，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用。研究表明，豬飼料中過(guò)量賴(lài)氨酸與精氨酸不存在拮抗作用[39]。在本研究中，賴(lài)氨酸水平為6%時(shí)，血淋巴代謝物精氨酸含量上升，賴(lài)氨酸與精氨酸未出現(xiàn)拮抗作用。高水平賴(lài)氨酸是否與精氨酸存在拮抗作用尚需進(jìn)一步研究。

嘌呤在動(dòng)物體內(nèi)主要以嘌呤核苷酸的形式存在，在作為能量供應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)等方面有著重要作用。腺苷是合成腺嘌呤的重要中間體。本研究中嘌呤檢測(cè)出差異的有腺嘌呤、黃嘌呤。腺嘌呤、黃嘌呤與腺苷一起富集到嘌呤代謝途徑中，最終生成尿酸。黃嘌呤、尿酸在飼糧6%賴(lài)氨酸組飼喂下工蜂血淋巴中含量高于0%賴(lài)氨酸組。在昆蟲(chóng)體內(nèi)，嘌呤代謝的最終產(chǎn)物是尿酸[40]。尿酸具有抗氧化功能，可減少自由基對(duì)蛋白質(zhì)、DNA 及膜脂質(zhì)的損害[41]。但是，飼糧賴(lài)氨酸水平在6%下工蜂血淋巴代謝物腺苷、腺嘌呤呈下調(diào)趨勢(shì)，對(duì)于這一現(xiàn)象的原因是否與賴(lài)氨酸含量過(guò)高有關(guān)還需進(jìn)一步研究。

輔酶A是一種含有泛酸的輔酶，是多種酶反應(yīng)通路的輔助因子，參與物質(zhì)代謝，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力[42]。輔酶A的乙?；问绞且阴］o酶A，碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)都會(huì)通過(guò)乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)出差異倍數(shù)較大代謝物為L(zhǎng)-酵母氨酸、哌啶酸，且含量均為上調(diào)，這可能與賴(lài)氨酸分解代謝有關(guān)。賴(lài)氨酸可經(jīng)過(guò)酵母氨酸途徑與哌啶酸途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A參與TCA循環(huán)。

在本研究中，飼糧中賴(lài)氨酸水平的增加提高了熊蜂工蜂胸部肌肉蛋白含量與工蜂存活率，賴(lài)氨酸水平為6%時(shí)胸部肌肉蛋白含量與存活率最高。采用LC-MS 方法檢測(cè)飼喂賴(lài)氨酸缺乏組與6%賴(lài)氨酸組工蜂血淋巴代謝物，篩選鑒定出28種差異代謝物，主要涉及氨基酸與嘌呤的合成代謝途徑。綜上所述，考慮到飼糧6%賴(lài)氨酸組工蜂血淋巴代謝物中組胺、腺嘌呤等代謝物下降，熊蜂工蜂飼糧中賴(lài)氨酸水平為4%～6%時(shí)，更適合幼年工蜂的生長(zhǎng)發(fā)育與生存。

本文研究了不同賴(lài)氨酸水平對(duì)幼年地熊蜂的生長(zhǎng)及其血淋巴代謝物的影響，有助于探明地熊蜂工蜂賴(lài)氨酸的營(yíng)養(yǎng)需求，更好地了解氨基酸在熊蜂飼糧中的重要性，為熊蜂規(guī)?；曫B(yǎng)和授粉應(yīng)用中的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充提供部分理論依據(jù)。