DNA依賴性蛋白激酶催化亞基在非同源末端連接修復(fù)中作用的研究進(jìn)展

張?zhí)鞐?，趙樂天，廖明星，李仁燕

(國家衛(wèi)生健康委出生缺陷與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400020)

DNA是最重要的遺傳物質(zhì)，在維持機(jī)體新陳代謝和平衡的生命活動(dòng)中，DNA持續(xù)發(fā)生不同程度的損傷，其中雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)最為嚴(yán)重且普遍存在，每個(gè)細(xì)胞每天大約經(jīng)歷10～100次DSB[1]。造成DSB的因素有外源性(電離輻射、化療藥物和機(jī)械損傷等)和內(nèi)源性(氧化自由基、細(xì)胞代謝產(chǎn)物與復(fù)制叉崩塌等)。病理性DSB會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯、細(xì)胞死亡和染色質(zhì)重排，后者易造成癌基因的活化或抑癌基因的失活，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DSB后，主要有兩條修復(fù)途徑，即同源重組(homologous recombination，HR)修復(fù)與非同源末端連接(nonhomologous DNA end joining，NHEJ)修復(fù)。HR修復(fù)依賴完全相同的同源染色體為模板進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)，主要發(fā)生在細(xì)胞S和G2期[3]。NHEJ途徑則不需要修復(fù)模板，通過修復(fù)相關(guān)因子，直接連接損傷的DNA兩端，修復(fù)速度快，但容易產(chǎn)生錯(cuò)誤(包括缺失、插入和點(diǎn)突變)，可在整個(gè)細(xì)胞周期發(fā)生，主要發(fā)生在G0/G1期[4]。當(dāng)高能粒子或射線誘導(dǎo)DSB，則優(yōu)先通過NHEJ途徑修復(fù)損傷的DNA[5-6]。

經(jīng)典的NHEJ修復(fù)(classical NHEJ，C-NHEJ)過程包括由Ku70/80組成的異二聚體對(duì)DSB的識(shí)別，募集DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)至損傷的DNA末端，內(nèi)切酶Artemis對(duì)DNA末端剪切，多聚酶填補(bǔ)空缺脫氧核苷酸，再由連接酶復(fù)合體X射線交叉互補(bǔ)蛋白4(X-ray cross-complementing protein 4，XRCC4)、XRCC4樣因子(XRCC4-like factor，XLF)和連接酶IV(ligase IV)，連接損傷的DSB兩端，修復(fù)成完整的DNA鏈[7]。由Ku70/80異二聚體與DNA-PKcs形成的DNA-PK復(fù)合體，在NHEJ修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中DNA-PKcs屬于磷脂酰肌醇3-激酶樣蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase-like protein kinase，PIKK)家族成員，其激酶活性在NHEJ修復(fù)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，當(dāng)DNA-PKcs激酶失活，導(dǎo)致輻射敏感性和DSB修復(fù)缺失的增加，也可導(dǎo)致可變區(qū)(variable，V)、多樣區(qū)(diversity，D)、連接區(qū)(joining，J)重組與免疫缺失[8]。本文綜述了DNA-PKcs的蛋白結(jié)構(gòu)特征，及其如何被募集到DSB位點(diǎn)，如何被激活發(fā)揮NHEJ修復(fù)作用，同時(shí)結(jié)合目前新的研究發(fā)現(xiàn)，總結(jié)DNA-PKcs自身構(gòu)象的變化對(duì)其發(fā)揮生物學(xué)功能的影響，為進(jìn)一步深入研究DNA-PKcs在DSB修復(fù)中的重要作用以及相關(guān)疾病的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。

1 DNA-PKcs的結(jié)構(gòu)

DNA-PKcs由4 128個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)N端HEAT結(jié)構(gòu)域，隨后是FRAP、ATM和TRRAP(FAT)結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短C端區(qū)域稱為FATC結(jié)構(gòu)域(圖1)[9]。N端HEAT結(jié)構(gòu)域中的重復(fù)序列是DNA-PKcs所特有的，它和中間結(jié)構(gòu)域M-HEAT形成螺旋，也稱為圓形支架，發(fā)揮著與Ku異二聚體及DNA末端結(jié)合的關(guān)鍵作用[10-11]。同時(shí)在M-HEAT結(jié)構(gòu)域中，主要有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)簇，ABCDE(T2609、S2612、T2620、S2624、T2638和T2647)與PQR位點(diǎn)簇(S2023、S2029、S2041、S2051、S2053和S2056)[12-15]，分別以T2609與S2056位點(diǎn)為代表[16]。研究表明，當(dāng)DNA-PKcs與Ku70/80及DNA末端結(jié)合后，ABCDE簇發(fā)生自磷酸化或被ATM磷酸化，使DNA-PKcs構(gòu)象發(fā)生變化，激活內(nèi)切酶Artemis對(duì)DNA末端剪切，促進(jìn)DNA-PKcs的PQR發(fā)生自磷酸化，進(jìn)而使DNA-PKcs與Ku蛋白復(fù)合體解離，釋放DNA-PKcs對(duì)DNA末端的物理阻斷，有利于DNA末端連接酶發(fā)揮作用[17]。

圖1 DNA-PKcs的結(jié)構(gòu)[9]

由于DNA-PKcs相對(duì)分子質(zhì)量太大，難以通過重組方式在細(xì)胞中表達(dá)，阻礙了其在細(xì)胞中功能的研究。通過對(duì)跨物種的DNA-PKcs序列分析，發(fā)現(xiàn)了高度保守且維持重要作用的氨基酸序列，其中包括M-HEAT結(jié)構(gòu)域中的Forehead(892-1 289 aa)、NUC194(1 815-2 202 aa)和YRPD(2 772-2 784 aa)序列，以及FAT和激酶催化結(jié)構(gòu)域[9]。值得注意的是，通過比對(duì)分析脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、變形蟲、卵菌、霉菌和植物的YRPD結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在不同物種中，其序列保持不變，表明它對(duì)DNA-PKcs的功能至關(guān)重要[18]。

2 DNA-PKcs在DSB位點(diǎn)的募集與激活

在NHEJ修復(fù)過程中，Ku70/Ku80通過識(shí)別DSB，包圍損傷DNA末端的15 bp，形成一個(gè)松散的環(huán)來啟動(dòng)NHEJ，Ku蛋白對(duì)DSB的識(shí)別無序列特異性[19]。Ku蛋白結(jié)合到DNA末端后，促進(jìn)DNA-PKcs在DSB位點(diǎn)的募集，DNA-PKcs與DNA末端結(jié)合后，將Ku異二聚體向DSB末端內(nèi)部推進(jìn)[20-21]。當(dāng)DSB上無Ku蛋白，DNA-PKcs與DSB的親和力明顯降低，僅有約20%的結(jié)合，且DNA-PKcs激酶活性很低。當(dāng)DSB上有Ku蛋白存在時(shí)，DNA-PKcs被募集至DNA末端，其活性增加5～10倍[22]。

DSB末端直接與DNA-PKcs的DNA末端結(jié)構(gòu)域(DNA end binding，DEB)結(jié)合。DEB結(jié)構(gòu)域是由DEB附加螺旋(DEBappended helix，DEB-A)(2 724-2 730 aa)、連接體(6個(gè)氨基酸)和DEB螺旋(2 736～2 767 aa)組成[9](圖2)。在脊椎動(dòng)物中，Ku80包含1個(gè)C端區(qū)域(C-terminal region，CTR)和1個(gè)靈活的尾巴，對(duì)DNA-PKcs的激活發(fā)揮作用[23]。研究表明，DNA-PKcs與Ku80的C端保守序列EEGGDVDDLLDMI(720-732 aa)結(jié)合[24-25]，其中Ku80(725-731 aa)形成了1個(gè)離散的a-螺旋，與DNA-PKcs的NUC194結(jié)構(gòu)域(1 815-2 202 aa)相互結(jié)合，從形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)來看，DNA-PKcs的1 912～1 923 aa與1 955～1 970 aa之間的螺旋結(jié)構(gòu)，很可能直接與Ku80 CTR結(jié)合[26]。

圖2 DNA-PKcs與DNA末端結(jié)合位點(diǎn)示意圖[9，26]

Ku異二聚體與DNA-PKcs組成DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)，是NHEJ修復(fù)通路的關(guān)鍵因子。Chaplin等[27]也發(fā)現(xiàn)了Ku80-CTR的類似結(jié)構(gòu)特征，Ku80 CTR的尾部延伸到另一個(gè)損傷DNA末端的DNAPKcs分子中，這可能有助于兩個(gè)損傷DNA末端的連接。由DNA-PKcs、Ku70/80和dsDNA組成的復(fù)合物，包含兩個(gè)XRCC4同源二聚體，每個(gè)同源二聚體與一個(gè)Lig4分子結(jié)合，并通過它們的頭部結(jié)構(gòu)域與單個(gè)XLF同源二聚體連接，形成遠(yuǎn)程連接復(fù)合體[9]。這將有助于損傷的兩個(gè)DSB末端靠近排列，形成連接復(fù)合體，促進(jìn)DSB末端的連接和保護(hù)，以避免異常降解或連接，同時(shí)DNA-PKcs被激活[26]。

3 DNA-PKcs在NHEJ修復(fù)中的作用過程

激活后的DNA-PKcs能夠使自身及相關(guān)修復(fù)因子磷酸化，其中ABCDE與PQR位點(diǎn)簇的自磷酸化對(duì)NHEJ修復(fù)發(fā)揮至關(guān)重要的作用[28]。電離輻射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA-PKcs從DSB位點(diǎn)釋放，其半衰期約為1 h，但ABCDE與PQR位點(diǎn)簇中S2056突變?yōu)闊o法發(fā)生磷酸化的丙氨酸后，約60%的DNA-PKcs在誘導(dǎo)DSB后2 h，DNA-PKcs持續(xù)存在于DSB位點(diǎn)[29]，阻礙了連接酶對(duì)DSB的連接，抑制NHEJ修復(fù)[30]。在NHEJ修復(fù)過程中，DNA-PKcs的ABCDE與PQR位點(diǎn)簇，其自身構(gòu)象如何變化，以及如何發(fā)揮功能，是多年來研究的熱點(diǎn)[23，27]。

DNA-PKcs的N-HEAT與M-HEAT各形成一個(gè)開環(huán)結(jié)構(gòu)，與頂部相連。而FAT-Kinase-FATC區(qū)域位于開環(huán)結(jié)構(gòu)的頂部，像一個(gè)王冠[11，27](圖3)。DNA-PKcs與DNA末端結(jié)合，并將Ku異源二聚體向內(nèi)推進(jìn)[20-21]。在激活過程中，DNA-PKcs的PI3K調(diào)節(jié)區(qū)域(PI3K-regulatory domain，PRD)旋轉(zhuǎn)115度，以暴露催化結(jié)構(gòu)域中底物與ATP結(jié)合凹槽。PRD結(jié)構(gòu)域在ATM和ATR激酶中也發(fā)揮類似作用，是PIKKs家族的一個(gè)共同特征[31]。PRD的旋轉(zhuǎn)和激酶結(jié)構(gòu)域的提升，使N-HEAT和M-HEAT向催化結(jié)構(gòu)域彎曲，類似于一個(gè)彎曲的膝蓋，ABCDE簇自磷酸化，使DNA末端暴露，這種構(gòu)象允許DNA-PKcs將DNA末端呈現(xiàn)給其他NHEJ修復(fù)因子。如內(nèi)切酶Artemis，對(duì)DNA末端(如發(fā)夾、5′或3′懸垂、氣泡和環(huán)等結(jié)構(gòu))進(jìn)行適當(dāng)剪切，便于末端連接，同時(shí)DNA-PKcs保護(hù)DNA末端免受其他因素?fù)p傷[15，31-32]。因此，激酶活性缺失或ABCDE的突變，會(huì)遮蓋DNA末端，以阻止NHEJ進(jìn)程。如純化的DNA-PKcs未發(fā)生自磷酸化，將會(huì)阻斷T4連接酶介導(dǎo)的末端連接[33]。ABCDE簇除了分子間的自磷酸化(通過另一個(gè)的DNA-PKcs)，還可能是分子內(nèi)的自磷酸化或被ATM磷酸化。

圖3 DNA-PKcs的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[11，27]

當(dāng)DNA末端如發(fā)夾結(jié)構(gòu)被Artemis等內(nèi)切酶打開，促進(jìn)DNA-PKcs的PQR位點(diǎn)簇自磷酸化，使DNA-PKcs被完全激活，PQR簇引入帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，導(dǎo)致DEB/DEB-A通過電荷排斥DSB末端，使DSB末端從DEB中釋放，DNA-PKcs從DNA末端及Ku復(fù)合體中解離[9，17]。接下來，兩個(gè)DNA末端的Ku異二聚體與連接酶復(fù)合體XRCC4-DNA Ligase IV-XLFXRCC4-DNA Ligase IV形成短程連接復(fù)合體，使DSB末端水平對(duì)齊排列，易于連接酶復(fù)合體對(duì)損傷DNA末端連接，從而修復(fù)形成完整的DNA鏈[26]。DNA-PKcs自磷酸化觸發(fā)從遠(yuǎn)程連接復(fù)合體到短程連接復(fù)合體的轉(zhuǎn)變[26]。DNA-PKcs保護(hù)DNA末端不被過早處理、連接和降解，直到兩個(gè)斷裂的末端被正確定位后，才從損傷DNA兩端解離，釋放物理空間，便于斷裂的DNA末端連接[34]。在NHEJ修復(fù)過程中，DNA-PKcs的自磷酸化，DNA末端加工和連接的協(xié)調(diào)均需高度調(diào)控，相關(guān)的具體機(jī)制尚待研究[9]。

4 DNA-PKcs與疾病

4.1 DNA-PKcs與腫瘤

DNA-PKcs參與了典型的腫瘤通路，包括DNA損傷檢查點(diǎn)調(diào)控、細(xì)胞周期控制、有絲分裂調(diào)控、微管動(dòng)力學(xué)和染色體分離[35]。同時(shí)NHEJ是基因組重排的一個(gè)關(guān)鍵來源，并增加了細(xì)胞中惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[36]。DNA-PKcs在腫瘤中發(fā)揮重要作用，特別是在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、胃癌(gastric carcinoma，GC)和結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer，CRC)中的研究比較廣泛，明確了DNA-PKcs在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要作用，有助于發(fā)現(xiàn)治療靶點(diǎn)和新的生物標(biāo)志物。

DNA-PKcs與腫瘤發(fā)生的易感性相關(guān)。在537例結(jié)直腸癌病例中有72例(13.4%)發(fā)生DNA-PKcs突變，提示DNA-PKcs與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。Wang等[37]的癌癥病例表明，DNAPKcs可增加胰腺癌和乳腺癌的易感性。Zheng等[38]證實(shí)了DNAPKcs在腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)細(xì)胞中過表達(dá)。除上述癌癥外，也有報(bào)道稱食管癌中DNA-PKcs的表達(dá)增加[39]。

此外，DNA-PKcs通過刺激血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。DNA-PKcs在RCC細(xì)胞中過度異常表達(dá)，調(diào)節(jié)mTORC2 AKT活化、HIF-2a表達(dá)，促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖[38]。DNA-PKcs的藥理學(xué)或遺傳抑制，也可抑制RCC細(xì)胞的增殖。據(jù)報(bào)道，DNA-PKcs在大多數(shù)GC亞型中過度表達(dá)，并且DNA-PKcs敲除可導(dǎo)致增殖減少和細(xì)胞周期停滯[40]。

Sun等[41]報(bào)道DNA-PKcs的表達(dá)與臨床分期、淋巴浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和5年生存率有關(guān)。癌組織中DNA-PKcs上調(diào)，DNAPKcs高表達(dá)的患者總體生存率較低。Zhang等[42]研究顯示DNAPKcs在多個(gè)乳腺癌亞型中過度表達(dá)，這與患者的低生存率相關(guān)。DNA-PKcs與GC患者低生存率相關(guān)[40]。因此，DNA-PKcs是腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)。Davidson等[43]利用DNA-PKcs的小分子抑制劑NU7026和IC486241處理，可以顯著提高CRC細(xì)胞系中的療效。

4.2 DNA-PKcs與其他疾病

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)患者大腦皮質(zhì)提取物中的NHEJ水平降低，同時(shí)AD腦提取物[44]中的DNA-PKcs水平顯著降低。在最近的一項(xiàng)研究中，亞致死水平的聚集Aβ，已被證明可以抑制PC12細(xì)胞中的DNA-PK活性，其中一個(gè)潛在的機(jī)制可能是Aβ介導(dǎo)的ROS，導(dǎo)致DNA-PKcs降解[45]。Aβ還能誘導(dǎo)DNA-PKcs碳基化，這是一種不可逆的蛋白氧化修飾，可能觸發(fā)蛋白酶體降解[46-47]。對(duì)于其他與DNA-PKcs一樣重要的NHEJ成分(如Ku，Artemis)，它們?cè)贏D中的作用仍未被闡明。

DNA-PKcs也與免疫相關(guān)。據(jù)報(bào)道顯示小鼠DNA-PKcs種系突變，導(dǎo)致嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷，選擇體細(xì)胞突變或小分子抑制劑使DNA-PKcs激酶失活，導(dǎo)致DSB修復(fù)缺陷，促進(jìn)基因組不穩(wěn)定性[48]。另外，DNA-PKcs可通過NF-κB通路，激活黏附分子VCAM和炎癥細(xì)胞因子TNF，促進(jìn)先天性免疫與炎癥的發(fā)生[49]。

DNA-PKcs與衰老也具有相關(guān)性。研究表明，老年小鼠比年輕小鼠的細(xì)胞中含更多的DSB，在細(xì)胞衰老過程中，基因組的完整性和DNA損傷后NHEJ的修復(fù)效率顯著下降，導(dǎo)致與年齡相關(guān)的基因組不穩(wěn)定及衰老的發(fā)生[50]。

5 結(jié)語

DNA-PKcs被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的潛在驅(qū)動(dòng)因素，可作為晚期惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。目前DNA-PKcs的幾種選擇性小分子抑制劑Nedisertib、AZD7648、VX-984和CC-115已經(jīng)進(jìn)入臨床階段[47]。對(duì)NHEJ修復(fù)過程中，DNA-PKcs的結(jié)構(gòu)變化、作用過程等的解析，不僅有助于研究NHEJ修復(fù)過程中的結(jié)構(gòu)連接復(fù)合體，還可以靶向設(shè)計(jì)變構(gòu)構(gòu)象的NHEJ抑制劑，從而提高治療的特異性和治療潛力。此外，關(guān)于DNA-PKcs在腫瘤等疾病中的確切作用及其潛在的分子機(jī)制，目前仍不十分清楚，未來需要持續(xù)研究，以開發(fā)針對(duì)DNA-PKcs的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。