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    脫水淫羊藿素維持人尿源性干細(xì)胞干性的作用研究

    2022-12-02 10:42:36張憶雪譙英固王呈諭孫震曉
    癌變·畸變·突變 2022年6期
    關(guān)鍵詞:干性充質(zhì)干細(xì)胞

    張憶雪,周 明,譙英固,王呈諭,孫震曉

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 102488)

    人尿源性干細(xì)胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)是從人尿液中分離培養(yǎng)出的一種具有良好增殖活性和多向分化能力的細(xì)胞亞群[1]。研究表明,hUSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的多種生物學(xué)特征,且取材方便、無創(chuàng)、成本較低,在組織修復(fù)、疾病治療等領(lǐng)域均有重要的研究價值[2-5]。然而,hUSCs與其他干細(xì)胞一樣,也存在隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加,細(xì)胞干性逐漸減弱的問題,一定程度上影響了hUSCs的有效應(yīng)用[6]。

    Bharadwaj等[7]研究發(fā)現(xiàn),來自不同個體所培養(yǎng)的hUSCs均高表達(dá)腎臟及腎小球足細(xì)胞的特異基因和蛋白標(biāo)志物,揭示hUSCs可能來源于腎臟。淫羊藿作為補(bǔ)腎中藥的代表,具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效[8]。淫羊藿苷(icariin,ICA)是淫羊藿的主要活性成分,口服后經(jīng)腸道細(xì)菌分解能夠產(chǎn)生脫水淫羊藿素(dehydrated icaritin,DICT)等多種代謝產(chǎn)物[9-10]。研究發(fā)現(xiàn),DICT能夠有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,修復(fù)裸鼠臨界性顱骨缺損[11-12]。此外,基于課題組前期利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(traditional Chinese medicine systems pharmacology,TCMSP)數(shù)據(jù)庫和分子對接技術(shù)對維持hUSCs干性的小分子化合物進(jìn)行篩選所得到的結(jié)果來看,DICT可能具有潛在的維持hUSCs干性的作用(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此,本研究以hUSCs為研究對象,探討DICT對其干性的影響,為后續(xù)開展hUSCs相關(guān)研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 藥品

    脫水淫羊藿素,純度≥99%,購自上海源葉生物科技有限公司(批號YA0903SA13)。

    1.2 主要試劑與儀器

    角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte serum free medium,KSFM)培養(yǎng)基、高糖-DMEM培養(yǎng)基、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)細(xì)胞培養(yǎng)添加物購自Gibco公司;Ham’s F12培養(yǎng)基購自Corning公司;青霉素-鏈霉素購自Amresco公司;胎牛血清購自Biological Industries公司;人表皮生長因子EGF購自美國Peprotech公司;胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa)購自北京拜爾迪生物科技有限公司;四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司;PE-Cy7鼠抗人CD31、PE鼠抗人CD34、FITC鼠抗人CD44、APC鼠抗人CD90抗體均購自BD Pharmingenn公司;大容量多管離心機(jī)(LXJ-IIB)購自安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司;MCO-18AIC(UV)細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Sanyo公司;ECLIPSE TE2000-S倒置相差顯微鏡購自Nikon公司;酶標(biāo)儀購自Bio-Tek公司;流式細(xì)胞儀(Beckman CytoFLEXS)購自美國Beckman公司;實(shí)時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM6 Flex)購自美國Thermo公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 hUSCs的分離與培養(yǎng)無菌條件下收集健康志愿者新鮮尿液樣本200~300 mL至無菌燒杯中。參照文獻(xiàn)[13],室溫下以1 000 r/min離心10 min,棄上清,用1 mL PBS緩沖液洗滌沉淀,室溫下再以1 000 r/min離心5 min,棄上清,用1 mL hUSCs培養(yǎng)基輕柔重懸細(xì)胞后將其均勻接種在24孔板中,置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃條件培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),記為P0代。培養(yǎng)后第3天補(bǔ)500μL培養(yǎng)基,第5、6天分別半換液,之后每48 h進(jìn)行一次半換液,待細(xì)胞長至匯合度為90%~100%時用胰酶消化傳代。通過倒置相差顯微鏡觀察hUSCs的細(xì)胞形態(tài),并拍照記錄。

    1.3.2 MTT法檢測hUSCs生長曲線及DICT對hUSCs活力的影響取生長狀況良好的P2代細(xì)胞,經(jīng)0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞以1 000個/孔的密度接種在96孔板中,每孔200μL培養(yǎng)基,設(shè)6個復(fù)孔,培養(yǎng)7 d。每天在鋪板同一時間點(diǎn)前4 h更換為100μL MTT工作液,繼續(xù)在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃條件下孵育4 h,棄去MTT培養(yǎng)基,每孔加入150μL DMSO,震蕩10~15 min至MTT代謝產(chǎn)物藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解,用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測吸光值,并繪制hUSCs的時間-吸光度生長曲線。DICT處理組細(xì)胞接種培養(yǎng)方法同上,培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁并且生長良好時,去除培養(yǎng)基,分別加入含有0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L脫水淫羊藿素的培養(yǎng)基200μL,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),作用時間為1~7 d。后續(xù)處理同上。按下列公式計算細(xì)胞活力。

    細(xì)胞活力=D(570)DICT藥物組/D(570)對照組×100%

    1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測hUSCs表面標(biāo)志物取生長狀況良好的hUSCs的P2代細(xì)胞,經(jīng)0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,PBS緩沖液洗滌重懸細(xì)胞,將細(xì)胞濃度調(diào)整為6×105個/mL,分別取200μL細(xì)胞懸液于兩個5 mL EP管中,并加入小鼠抗人抗體CD34-PE、CD31-PE-Cy7及CD44-FITC、CD90-APC,4℃、避光條件下孵育30 min,再加500μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞,室溫下以300 g離心5 min,棄上清,加入200 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞,過濾后上流式細(xì)胞儀檢測[14]。

    1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測干性相關(guān)基因OCT-4、C-MYC的表達(dá)經(jīng)文獻(xiàn)挖掘,與間充質(zhì)干細(xì)胞干性相關(guān)的基因包括OCT-4、C-MYC、SOX2、NANOG、REX1等。Sato等[15]發(fā)現(xiàn)BIO能通過激活Wnt信號通路促進(jìn)胚胎干細(xì)胞干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OCT-4、REX1和NANOG的表達(dá),從而維持胚胎干細(xì)胞干性和自我更新能力。李佳瑋等[16]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中OCT-4、SOX2、NANOG、C-MYC等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),提高細(xì)胞的干性水平。課題組前期研究表明,作為成體干細(xì)胞,hUSCs中的OCT-4、C-MYC基因表達(dá)較穩(wěn)定,與其干性相關(guān)性強(qiáng)。因此,本研究首先選擇OCT-4、C-MYC兩種基因作為判斷hUSCs干性強(qiáng)弱的檢測指標(biāo)。OCT-4、C-MYC與干細(xì)胞的干性維持密切相關(guān),一般隨著干細(xì)胞繼代次數(shù)增加表達(dá)下降[17-19]。取生長狀況較好的P4代細(xì)胞,經(jīng)0.25%胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于6孔板中,每組平行設(shè)置2個復(fù)孔,每孔加入1.5 mL培養(yǎng)基,在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁并且生長良好時,去除培養(yǎng)基,加入含有2.0 μmol/L脫水淫羊藿素的培養(yǎng)基2.5 mL,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生物學(xué)形態(tài),并拍照記錄。先按照RNA pure Total RNA Kit說明書提取各組細(xì)胞的總RNA,再按照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)對基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)中所用引物的序列信息見表1。

    表1 引物序列信息

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS Statistics 20.0和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,采用t檢驗(yàn)對兩樣本均數(shù)進(jìn)行比較,采用單因素方差分析對多樣本均數(shù)進(jìn)行比較,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 原代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)hUSCs的形態(tài)學(xué)觀察

    見圖1。從健康志愿者新鮮尿液中分離培養(yǎng)的hUSCs于接種后24~72 h后開始貼壁(圖1A),大約6~8 d后細(xì)胞逐漸形成集落(圖1B),8~12 d后細(xì)胞開始呈克隆狀生長(圖1C),大約16 d后細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)到約90%~100%的匯合度(圖1D)開始進(jìn)行第1次傳代培養(yǎng),23 d后P2代細(xì)胞仍保持活力,形態(tài)呈飽滿的梭形(圖1E),35 d后P4代細(xì)胞形態(tài)仍保持良好(圖1F)。

    圖1 hUSCs原代及繼代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

    2.2 hUSCs細(xì)胞生長曲線

    MTT法檢測hUSCs細(xì)胞體外生長曲線,結(jié)果如圖2所示,基本呈S型曲線,1~4 d hUSCs增殖較快,細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)生長期,5~7 d細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期。

    圖2 hUSCs生長曲線

    2.3 hUSCs的表面標(biāo)志物鑒定

    流式細(xì)胞術(shù)測定hUSCs表面標(biāo)志物結(jié)果如圖3所示,實(shí)驗(yàn)所用P2代hUSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44陽性率為74.10%,CD90陽性率為99.94%,CD34陽性率為2.12%,CD31陽性率為0.10%,表明hUSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90和CD44,幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31。

    圖3 hUSCs表面標(biāo)志物抗原表達(dá)

    2.4 DICT對hUSCs活力的影響

    MTT檢測0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L DICT對hUSCs細(xì)胞活力的影響,結(jié)果如圖4所示,6個濃度的DICT作用于hUSCs 3~6 d后,均有維持其細(xì)胞活力的作用。與對照組比較,DICT給藥濃度為2.0 μmol/L時,第3~6天細(xì)胞活力均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);給藥濃度為1.5和2.5μmol/L時,第3~5天細(xì)胞活力均明顯升高(P<0.01),第6天差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第7天時細(xì)胞活力均處于較低水平。綜合考慮,實(shí)驗(yàn)選用2.0μmol/L的DICT進(jìn)行后續(xù)干性基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

    圖4 DICT對hUSCs細(xì)胞活力的影響

    2.5 DICT作用后hUSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

    對2.0μmol/L DICT分別作用3 d和7 d后的P4代hUSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果如圖5所示,與對照組相比,2.0μmol/L DICT作用hUSCs 3 d后的生物學(xué)形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量基本無明顯變化;作用7 d后,hUSCs雖形態(tài)上變化不大,但細(xì)胞數(shù)量有所增加。

    圖5 DICT作用于hUSCs的形態(tài)學(xué)觀察

    2.6 DICT對hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表達(dá)的影響

    qPCR結(jié)果如圖6所示,與對照組對比,2.0μmol/L DICT組hUSCs干性基因OCT-4和C-MYC的mRNA表達(dá)量均顯著升高(P<0.01),表明2.0μmol/L DICT可使hUSCs干性基因OCT-4和C-MYC的表達(dá)上調(diào)。

    圖6 DICT對hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表達(dá)的影響

    3 討論

    人尿源性干細(xì)胞作為一種來源廣泛、可在體外大量增殖的成體干細(xì)胞,現(xiàn)已在心血管、皮膚、骨骼修復(fù)以及疾病細(xì)胞造模等方面得到廣泛應(yīng)用[20-22],但也存在著傳代過程中隨代數(shù)增加細(xì)胞出現(xiàn)衰老、分化等問題[23]。本研究基于課題組前期篩選結(jié)果、實(shí)驗(yàn)研究及相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研[24-26],推測DICT可能具有維持hUSCs干性的作用,并選擇OCT-4、C-MYC兩種基因作為判斷hUSCs干性強(qiáng)弱的檢測指標(biāo),在細(xì)胞及分子層面上分別探究DICT對hUSCs干性的影響。通過常溫離心法成功培養(yǎng)出形態(tài)良好、具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征的hUSCs,離心這一過程可將尿液中脫落的上皮細(xì)胞及雜質(zhì)去除,隨著繼代培養(yǎng)過程,尿液中其他存活的細(xì)胞不再增殖,僅hUSCs仍保持旺盛的增殖能力。此外,通過MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定DICT增強(qiáng)hUSCs活性的最適濃度,通過qPCR進(jìn)一步探究了DICT對hUSCs干性基因OCT-4和C-MYCmRNA表達(dá)的影響,結(jié)果表明,DICT在一定濃度下具有維持hUSCs干性的作用。

    研究表明,影響間充質(zhì)干細(xì)胞干性的相關(guān)基因除OCT-4、C-MYC外還有NANOG、SOX2、REX1等,我們之前對這些基因在hUSCs中的表達(dá)及其與干細(xì)胞干性的相關(guān)性做過一些探索,發(fā)現(xiàn)SOX2和NANOG基因在hUSCs中低表達(dá)且表達(dá)不穩(wěn)定,REX1表達(dá)變化較小指示性較弱,而OCT4和C-MYC基因表達(dá)較穩(wěn)定且指示性強(qiáng)(結(jié)果未列出),因此在本文研究DICT對hUSCs干性基因的影響中首先選擇這兩種基因作為研究對象。后續(xù)我們需要進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)志性基因的檢測,如對一些干細(xì)胞分化相關(guān)基因如ALP、SOX9、PPAR-γ2等表達(dá)的檢測,并借助生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)手段深入闡明其相關(guān)作用機(jī)制,以進(jìn)一步確認(rèn)促進(jìn)hUSCs干性的小分子化合物,為hUSCs的研究與臨床應(yīng)用提供支持[27]。

    中醫(yī)經(jīng)典著作內(nèi)經(jīng)《素問·六節(jié)藏象論》中有記載“腎者,主蟄,封藏之本,精之處也”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“精”是生命的起源,主要儲存在腎中,因此被稱為腎精[28]。干細(xì)胞作為形成機(jī)體和各器官組織的原始細(xì)胞,在生命起源及生理功能上與“腎精”有較多共性,是腎精的重要細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)[29]。如前所述,淫羊藿是中醫(yī)臨床重要的補(bǔ)腎中藥之一[30],據(jù)文獻(xiàn)報道,淫羊藿苷及其他淫羊藿成分也具有一定的促間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化作用[31-33]。此外,有關(guān)淫羊藿主要成分與其他藥物聯(lián)用對間充質(zhì)干細(xì)胞的影響也逐漸被關(guān)注:有實(shí)驗(yàn)表明,淫羊藿苷與雌激素聯(lián)用較單用顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖,且能夠規(guī)避雌激素替代療法的副作用[34];淫羊藿苷與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用比單用促進(jìn)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的效果更好[35]。今后有關(guān)DICT及其他淫羊藿成分對干細(xì)胞增殖、分化及干性維持的研究還可以在多藥聯(lián)用、3D模型構(gòu)建等領(lǐng)域繼續(xù)探索,這對解析淫羊藿的補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效作用具有重要意義。

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