人參培養(yǎng)須根的大鼠致畸試驗(yàn)

劉 歡，梁 菲，李 瑩，吳莎莎，曹 璨，徐建文，劉 影，

(1．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150001；2．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)食品藥品安全評(píng)價(jià)中心，黑龍江 哈爾濱 150001)

人參為五加科多年生草本植物人參(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根，其主要成分包括人參皂苷、人參多糖及非皂苷成分等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參具有改善記憶力、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤以及提高免疫力等功效[2-4]，因此人參在功能性食品和人體健康研究領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注[5]。國內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)人參的需求不斷增加，為了解決人參資源的短缺問題，人參組織培養(yǎng)物即人參培養(yǎng)須根(人參為不定根)生產(chǎn)培養(yǎng)技術(shù)被逐漸應(yīng)用于人參及其生物活性成分的生產(chǎn)[6]。

人參培養(yǎng)須根可應(yīng)用于食品、保健品、藥品和膳食補(bǔ)充劑等，并且在日本、韓國等已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化[7]。近年來，我國也開始了人參培養(yǎng)須根的培養(yǎng)研究，但大部分集中在其培育及活性成分方面[8-9]，對(duì)其毒性研究鮮見報(bào)道。課題組之前的實(shí)驗(yàn)對(duì)其急性毒性、遺傳毒性等進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)[10]，但未對(duì)其致畸性進(jìn)行探究。因此，本文對(duì)人參培養(yǎng)須根進(jìn)行致畸性檢測(cè)，為其安全開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

人參培養(yǎng)須根由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供。人參培養(yǎng)須根由5年生園參須根誘導(dǎo)而來。培養(yǎng)平臺(tái)為1噸級(jí)植物生物反應(yīng)器，接種量6 kg，培養(yǎng)基600 L，培養(yǎng)溫度24℃，培養(yǎng)時(shí)間65 d。樣品為人參培養(yǎng)須根烘干樣，外觀呈淡黃色粉末，總皂苷含量2.6%。該樣品推薦用量為每日2 g，成人體質(zhì)量以60 kg計(jì)，則樣品用量相當(dāng)于0.033 g/kg。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)性成熟SD大鼠(90～100 d)，雌性80只，雄性40只，均購自遼寧長生生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2010-0001；在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(屏障環(huán)境)飼養(yǎng)，使用許可證號(hào)SYXK(黑)2017-008，溫度為21～23℃，濕度為55%～58%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所用的清潔級(jí)飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2009-0012。所有操作均符合哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(審批號(hào)HMUIRB20210004)。

1.3 主要試劑與儀器

甲醛和冰乙酸(北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司)，氫氧化鉀、水合氯醛和茜素紅(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，飽和苦味酸(上海信譽(yù)生物技術(shù)有限公司)，乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)等。

CX21生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Motic SMZ168-BL型體視顯微鏡(麥克奧迪事業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 劑量設(shè)置根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 致畸試驗(yàn)》中的劑量設(shè)置和前期研究基礎(chǔ)[10]，受試物劑量為2.0 g/kg(高劑量組)、4.0 g/kg(中劑量組)、8.0 g/kg(低劑量組)，分別相當(dāng)于人體推薦劑量的60.5、121、242倍。由于受試物密度小，膨脹性高，最大可灌胃劑量為5.0 g/kg，而本實(shí)驗(yàn)所需受試物濃度大，不適合灌胃，所以將樣品摻入飼料中。本課題組前期90天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[10]將大鼠攝食量設(shè)置為體質(zhì)量的8%，考慮到孕鼠的實(shí)際攝食量高于正常雌性大鼠，因此將攝食量以體質(zhì)量的10%計(jì)算，則相當(dāng)于飼料中添加樣品劑量分別為20.0、40.0、80.0 g/kg。用酪蛋白調(diào)節(jié)各組蛋白質(zhì)與對(duì)照組相同，對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料。

1.4.2 試驗(yàn)方法將雌雄以2∶1比例合籠。每日早晨檢查雌鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓則認(rèn)為該動(dòng)物已交配，當(dāng)日作為受孕“零天”，記作GD0。若5 d內(nèi)某只雌鼠未交配，則更換雄鼠。將檢出的受孕大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分到各組，每組16只，并編號(hào)、單籠飼養(yǎng)。在大鼠妊娠的6～15 d通過飼料連續(xù)給予受試物，對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料。動(dòng)物自由攝食及飲水，在妊娠的第0、6、9、12、15、20天稱量孕鼠體質(zhì)量，每日對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一般行為觀察。在大鼠妊娠第20天斷頭處死，迅速剖腹取出子宮稱取子宮連胎質(zhì)量和子宮質(zhì)量，以得出妊娠動(dòng)物的凈增質(zhì)量，記錄總著床數(shù)、總黃體數(shù)、活胎數(shù)、早死胎數(shù)、晚死胎數(shù)及吸收胎數(shù)。處死時(shí)對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行肉眼觀察，保存肉眼發(fā)現(xiàn)有改變的臟器。逐一記錄胎仔性別、體質(zhì)量、體長，檢查胎仔外觀有無異常。將存活胎鼠的1/2放入乙醇中固定3周，茜素紅染色，制作為胎鼠骨標(biāo)本并進(jìn)行檢查；另1/2胎鼠用Bouin's液固定2周，制作胎鼠內(nèi)臟標(biāo)本并進(jìn)行檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，孕鼠體質(zhì)量、增質(zhì)量、子宮質(zhì)量、總著床數(shù)、總黃體數(shù)、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、胎仔體質(zhì)量、體長等計(jì)量資料用單因素方差分析，內(nèi)臟畸形率、骨骼畸形率等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)胎仔的相關(guān)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)以窩為單位。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 人參培養(yǎng)須根對(duì)孕鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠一般狀況良好，被毛整潔，行動(dòng)靈活，反應(yīng)敏捷，進(jìn)食飲水正常，生長發(fā)育良好，未見流產(chǎn)或早產(chǎn)等異常反應(yīng)及體征。與對(duì)照組相比，各劑量組孕鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。表明人參培養(yǎng)須根對(duì)孕鼠的體質(zhì)量無明顯影響。

表1 人參培養(yǎng)須根對(duì)孕鼠體質(zhì)量和攝食量的影響(g，n=16)

2.2 人參培養(yǎng)須根對(duì)胚胎早期發(fā)育的影響

結(jié)果見表2。與對(duì)照組相比，人參培養(yǎng)須根各劑量組對(duì)胎鼠死亡率、胚胎吸收率、窩平均活胎數(shù)均無明顯影響(P＞0.05)。

表2 人參培養(yǎng)須根對(duì)大鼠胚胎早期發(fā)育的影響

2.3 人參培養(yǎng)須根對(duì)胎鼠生長影響

結(jié)果見表3。與對(duì)照組相比，人參培養(yǎng)須根各劑量組子宮質(zhì)量、胎鼠體長、體質(zhì)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 人參培養(yǎng)須根對(duì)胎鼠生長的影響

2.4 人參培養(yǎng)須根對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育的影響

結(jié)果見表4。與對(duì)照組相比，不同劑量的人參培養(yǎng)須根胎鼠的肋骨發(fā)育無明顯影響(P＞0.05)，胎鼠骨骼正常發(fā)育率均在98%以上。

表4 人參培養(yǎng)須根對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育的影響

2.5 人參培養(yǎng)須根對(duì)胎鼠內(nèi)臟發(fā)育的影響

結(jié)果見表5。與對(duì)照組相比，不同劑量的人參培養(yǎng)須根對(duì)胎鼠內(nèi)臟發(fā)育無明顯影響(P＞0.05)。

表5 人參培養(yǎng)須根對(duì)胎鼠內(nèi)臟發(fā)育的影響

3 討論

人參作為傳統(tǒng)名貴中藥材，不僅具有極高的藥用價(jià)值，近年來在保健品領(lǐng)域也受到越來越多的關(guān)注[11-12]。目前，人參野生資源稀少，而栽培人參由于栽培周期長、農(nóng)藥和重金屬污染等各種各樣的問題無法完全滿足市場(chǎng)需求。利用細(xì)胞工程手段通過培養(yǎng)植物細(xì)胞、組織或器官獲取有效物質(zhì)成為一種有效途徑。人參細(xì)胞和根系培養(yǎng)物生長快速，代謝產(chǎn)物穩(wěn)定，已經(jīng)廣泛作為人參田間栽培的替代品[13-14]。近年來，我國也開始了人參培養(yǎng)須根的培養(yǎng)研究，但大多集中在其培育及活性成分方面，人參培養(yǎng)須根研究中最主要的活性成分人參皂苷也被一些研究指出可能具有致畸毒性。Liu等[15]通過全胚胎培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rb1對(duì)大鼠、小鼠胚胎具有直接的致畸作用，主要表現(xiàn)在冠臀長度、頭長和體節(jié)數(shù)的減少。另外有研究提出，人參皂甙的致畸性具有濃度依賴性，越低的濃度可能會(huì)導(dǎo)致越嚴(yán)重的畸形，使得這種毒性更容易被忽略[16]。但也有研究認(rèn)為，產(chǎn)生致畸作用的人參皂苷劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人類正常攝入量，所以在女性懷孕期間正常服用人參并不會(huì)對(duì)自身及其胎兒產(chǎn)生不良影響[17]。因此，基于人群研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的這種矛盾結(jié)果，有必要對(duì)不同濃度的人參培養(yǎng)須根進(jìn)行致畸性研究，為其安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)按照GB 15193.14-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 致畸試驗(yàn)》的要求進(jìn)行了致畸試驗(yàn)[18]。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在人參培養(yǎng)根須為2、4和8 g/kg劑量下，受孕大鼠的體質(zhì)量未表現(xiàn)出明顯變化，胚胎總著床數(shù)、總黃體數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)無顯著差異，同時(shí)對(duì)胎鼠外觀、骨骼、內(nèi)臟無明顯致畸作用。表明在本研究條件下，人參培養(yǎng)須根無母體毒性、胚胎毒性和致畸性，未觀察到有害作用劑量。本課題組前期對(duì)人參培養(yǎng)根須進(jìn)行了急性毒性和90天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，均未發(fā)現(xiàn)其任何毒性作用，本研究證明了人參培養(yǎng)根須無致畸作用，完善了人參培養(yǎng)根須毒性作用評(píng)價(jià)證據(jù)，為人參培養(yǎng)須根的安全應(yīng)用提供了一定的毒理學(xué)支持，為其將來進(jìn)一步在藥品、食品、化妝品等下游領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。