裝載siRNA的納米陽離子脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

問天嬌，陳欣然，白 靖，鄭 穎，王雅鵑，于佩佩，崔京霞

(1．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011；2．石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050035；3．河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北省創(chuàng)新藥物研究與安全性評價重點實驗室，河北 石家莊 050017)

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一類長約20～25個核苷酸的雙鏈RNA分子，進(jìn)入細(xì)胞后可誘發(fā)同源mRNA的特異性降解，導(dǎo)致目標(biāo)基因沉默[1]。近年來RNA干擾(RNA interference，RNAi)藥物在疾病治療領(lǐng)域具有較好的開發(fā)潛力[2]。2018年世界上首款siRNA藥物Patisiran(商品名為Onpattro，Alnylam公司)，將siRNA靶向至甲狀腺素運載蛋白(transthyretin，TTR)，特異性沉默TTR的mRNA并阻斷蛋白生成，獲批準(zhǔn)用于臨床治療，這是RNAi技術(shù)發(fā)展史上的重大里程碑事件之一[3-4]。

雖然多項研究成果顯示出了RNAi藥物在腫瘤、基因疾病等治療上的應(yīng)用前景，如Liu等[5]研究表明，siRNA能有效抑制P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白7的表達(dá)，顯著提升耐紫杉醇細(xì)胞對藥物的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌多藥耐藥性。但在體內(nèi)實驗中，由于siRNA分子大、穩(wěn)定性差、易被血液中的核酸酶降解、難穿透細(xì)胞膜等弊端，很難到達(dá)靶位點發(fā)揮療效，因此，如何增加藥物穩(wěn)定性以及如何對體內(nèi)微量的siRNA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測和定量是siRNA藥物藥代動力學(xué)研究中的難題[6-7]。有研究報道了生物樣品中siRNA的定量方法，主要包括液質(zhì)聯(lián)用法、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)檢測法、基于雜交的酶聯(lián)免疫法、液相色譜分析法和熒光分析法等[8-10]?；赟YBR GreenⅠ染料的qPCR，操作簡便、靈敏度高和重現(xiàn)性好[11]。本團(tuán)隊在前期研究[12]已合成了目標(biāo)siRNA序列，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，并制備了該質(zhì)粒的納米隱形陽離子脂質(zhì)體。本文擬進(jìn)行該siRNA脂質(zhì)體的化學(xué)穩(wěn)定性考察，并探索siRNA及其脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

NOD SCID小鼠12只，SPF級，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SYXK(京)2021-007，使用許可證號為SYXK(冀)2021-007。小鼠飼于屏障環(huán)境，溫度25～27℃，濕度60%左右，維持12 h光照及12 h黑夜循環(huán)，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

DNaseⅠ購自TaKaRa公司，80%血清購自Gibco公司，qPCR相關(guān)試劑(SYBR混合物、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo dT)購自Invitrogen公司，表達(dá)siRNA的陽離子脂質(zhì)體和裸質(zhì)粒(pDual-oligo)由石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)有限公司制備。DYY-11型電腦三恒多用電泳儀，購于北京六一儀器廠，qPCR儀購于日本BIOER公司。

1.3 siRNA脂質(zhì)體酶切和血清中穩(wěn)定性檢測

裸質(zhì)粒和質(zhì)粒脂質(zhì)體采用課題組前期已構(gòu)建的靶向腫瘤多藥耐藥1(multidrug resistance，MDR1)基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒及裝載了該質(zhì)粒的納米隱形陽離子脂質(zhì)體[12]。

1.3.1 酶切穩(wěn)定性檢測取裸質(zhì)粒和質(zhì)粒脂質(zhì)體(以質(zhì)粒計)2μg，平行各設(shè)5份，其中4份分別加入2 μL DNaseⅠ(50 U/μL)，在加入DNaseⅠ后20 min、1 h、4 h、24 h時提取DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，以未加入DNaseⅠ的裸質(zhì)粒及脂質(zhì)體為對照，通過ImageJ軟件對電泳條帶進(jìn)行條帶灰度值測定，并計算各時間點DNA殘留率，以作用時間為橫坐標(biāo)，siRNA質(zhì)粒殘留率為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.2 血清中的穩(wěn)定性檢測取裸質(zhì)粒和質(zhì)粒脂質(zhì)體(以質(zhì)粒計)2μg，平行5份，其中4份分別加入80%血清為實驗組，以未加入血清的脂質(zhì)體及裸質(zhì)粒為對照，按1.3.1中的方法進(jìn)行后續(xù)瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 脂質(zhì)體的藥代動力學(xué)檢測

利用qPCR方法建立siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體檢測曲線，設(shè)5個濃度梯度，依次為1 000、100、10、1、0.1μg/mL，PCR反應(yīng)體系(SYBR混合物12.5μL，ddH2O 8.5μL，上、下游引物各1μL，模板2μL)，變性95℃、30 s，退火56℃、25 s，延伸72℃、30 s，循環(huán)40次完成PCR實驗，以siRNA脂質(zhì)體濃度的常用對數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)作圖，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將20μg siRNA裸質(zhì)粒及siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體通過尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，分別在給予受劑物后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、12 h、24 h取血，提取血液中總RNA，按照20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(dNTP混合物1μL、0.1 mol/L的DTT 2 μL、50μmol/L的Oligo dT 1μL、5×RT反應(yīng)緩沖液4μL、500 ng/μL的模板2μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、RNase out核酸酶抑制劑1μL、DEPC處理水8 μL)，在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37℃、50 min，70℃、15 min，得到反應(yīng)產(chǎn)物cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，設(shè)空白對照(不加模板的反應(yīng)系統(tǒng))，進(jìn)行PCR擴增，將所得的CT值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各時間點的藥物濃度(以siRNA質(zhì)粒計)，以時間為橫坐標(biāo)，藥物濃度為縱坐標(biāo)作圖，計算藥物的半衰期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用Origin 2019b統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖像處理。采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體化學(xué)穩(wěn)定性的檢測結(jié)果

2.1.1 在DNaseⅠ中的穩(wěn)定性結(jié)果顯示裸質(zhì)粒在DNaseⅠ中僅20 min就全部降解；而質(zhì)粒脂質(zhì)體降解較緩慢，20 min、1 h、4 h的DNA殘留率依次為(45.78±4.57)%、(34.69±5.22)%、(22.88±3.98)%，直到24 h仍有(20.16±2.47)%的殘留，與裸質(zhì)粒組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1和圖2。上述結(jié)果說明質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后得到有效的保護(hù)，siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性是其發(fā)揮藥效的必要前提。

圖1 裸siRNA質(zhì)粒和siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體在DNaseⅠ中的穩(wěn)定性(瓊脂糖電泳)

圖2 裸siRNA質(zhì)粒和siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體在DNaseⅠ中作用不同時間的DNA殘留率

2.1.2 在血清中的穩(wěn)定性結(jié)果顯示裸質(zhì)粒在80%血清中20 min時僅殘留(11.03±0.92)%，在1 h時基本全部降解；而質(zhì)粒脂質(zhì)體在20 min、1 h、4 h時DNA殘留率依次為(40.74±1.13)%、(26.61±0.98)%、(19.85±0.82)%，24 h時仍殘留(10.26±1.04)%，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3和表1。說明質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后得到有效的保護(hù)，可在血清中保持相對穩(wěn)定。

圖3 裸siRNA質(zhì)粒和siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體在80%血清中的穩(wěn)定性(瓊脂糖電泳)

表1 裸siRNA質(zhì)粒和siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體在80%血清中不同時間后的DNA殘留率/%

2.2 質(zhì)粒脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的定量檢測結(jié)果

qPCR對siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體藥代動力學(xué)檢測得到的曲線見圖4。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.023x+22.014，R2=0.989，表明該脂質(zhì)體在0.1～1 000μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在各時間點分別對小鼠體內(nèi)裸siRNA質(zhì)粒及siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體的濃度進(jìn)行檢測，經(jīng)過計算，脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒半衰期約為2 h，而裸質(zhì)粒僅為6 min，見圖5。

圖4 小鼠體內(nèi)siRNA脂質(zhì)體藥代動力學(xué)檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體藥代動力學(xué)檢測

3 討論

近年來，研究者對RNAi藥物的研發(fā)熱情較高，一些研究成果也逐漸顯示出了RNAi藥物在基因疾病以及腫瘤等治療上的應(yīng)用前景。但是RNAi的治療途徑尚不成熟，仍有一些障礙需要克服，包括其安全性、靶向性、遞藥系統(tǒng)、體內(nèi)穩(wěn)定性、定量研究等[13]。目前，為解決siRNA藥物在遞送時存在的穩(wěn)定性問題，大多數(shù)研究均借助了載體[14]，使用最廣泛的非病毒載體包括脂質(zhì)體、聚合物納米顆粒、肽、抗體和小分子等。脂質(zhì)體是一種理想的藥物載體，具有良好的生物相容性、非免疫原性、易于功能化等優(yōu)點，已用于包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的臨床治療[15]。對于siRNA分子的裝載和運輸常使用陽離子脂質(zhì)體[16-17]，陽離子脂質(zhì)體攜帶的正電荷可以中和siRNA帶的負(fù)電荷，形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)緊密，通過細(xì)胞膜的胞吞或融合作用進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，從而極大地延長循環(huán)時間，促進(jìn)siRNA的遞送。

siRNA藥物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等不同于化學(xué)藥物，其適用的檢測方法也不同。目前，已有多種方法用于生物基質(zhì)中siRNA的絕對定量，對于體外化學(xué)合成修飾和體內(nèi)載體表達(dá)的siRNA檢測，常使用qPCR方法[18]，將siRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對累積的擴增產(chǎn)物進(jìn)行定量。qPCR敏感度高、重復(fù)性好且能夠特異檢測出生物樣品中的siRNA[19]，是應(yīng)用于siRNA藥物體內(nèi)藥代動力學(xué)評價較為理想的方法。

陽離子脂質(zhì)體能夠保護(hù)核酸類藥物進(jìn)入體內(nèi)，是一種高效的遞送載體，它與siRNA帶的負(fù)電荷結(jié)合并將siRNA包封于內(nèi)部，起到保護(hù)作用[20]。為了進(jìn)一步確定陽離子脂質(zhì)體作為核酸類藥物載體的可靠性，對于含微量siRNA的血液樣品，在提取siRNA和反轉(zhuǎn)錄過程中難免會造成siRNA的降解和損失。本文首先對siRNA脂質(zhì)體在DNaseⅠ和血清中的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。結(jié)果提示，與裸質(zhì)粒相比，siRNA表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過脂質(zhì)體包封以后，在DNaseⅠ和血清中穩(wěn)定性顯著增加。隨后的藥代動力學(xué)研究結(jié)果提示經(jīng)脂質(zhì)體包裹siRNA在小鼠體內(nèi)半衰期明顯延長。

綜上所述，該脂質(zhì)體能夠延長藥物的作用時間，提高藥物的生物利用度。隨著納米制劑新技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，以脂質(zhì)體為代表的納米藥物遞釋系統(tǒng)因其優(yōu)越的理化性質(zhì)和優(yōu)異的生物相容性將受到更廣泛的關(guān)注。