大細(xì)胞肺癌移植瘤組織中HIF-1α、VEGF、Ki67、血清蛋白的表達(dá)及其與功能性血管數(shù)目的關(guān)系

吳 寶，白玉勤，李丹丹，楊占民，孔凡龍

(1．赤峰學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2．赤峰市腫瘤醫(yī)院/赤峰學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3．錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

大細(xì)胞肺癌(large cell lung cancer，LCLC)是肺癌的一種罕見的病理類型，占非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)的2%～3%[1]。與其他NSCLC相比，LCLC生長更快，轉(zhuǎn)移更早，惡性程度較高[2]，5年存活率約為15%～25%[3]。血管生成因子如缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible-factor-1α，HIF-1α)在NSCLC中的表達(dá)和作用已有較多研究報(bào)道[4]，但是在LCLC中尚未見相關(guān)研究。動(dòng)物切除組織制作病理學(xué)標(biāo)本過程中，因血流中斷、化學(xué)固定、酒精脫水步驟，通常會(huì)導(dǎo)致組織收縮、分子易位和抗原封閉等形成人工假象(artifacts)[5]。由日本山梨大學(xué)大野伸一教授研制開發(fā)的活體冷凍技術(shù)(in vivocryotechnique，IVCT)是在活體狀態(tài)下冷凍固定動(dòng)物靶器官，可揭示血液流動(dòng)狀態(tài)下的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，克服了傳統(tǒng)標(biāo)本制作方法因血流中斷帶來的缺血缺氧等弊端[6]。2008年，我們利用IVCT技術(shù)在異種移植人NSCLC模型上首次清晰觀察到血清蛋白分布，提出了腫瘤間質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)的血清蛋白分布與其相對分子質(zhì)量密切相關(guān)，揭示了功能性血管與IgM和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白表達(dá)的關(guān)系[7-9]，提出了“功能性血管”概念，但尚未研究NSCLC組織中的功能性血管數(shù)目。HIF-1α蛋白作為血管生成因子，與腫瘤組織血管生成密切相關(guān)。在IVCT技術(shù)制備的標(biāo)本上進(jìn)行各種蛋白免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry，IHC)，染色結(jié)果尤為清晰、準(zhǔn)確定位。為了研究LCLC中功能性血管與HIF-1α蛋白表達(dá)關(guān)系，本研究取大細(xì)胞肺癌Lu65和Lu99細(xì)胞移植瘤石蠟包埋組織，采用IHC法分析HIF-1α、VEGF、Ki67及血清蛋白Albumin、IgG、IgM的表達(dá)，旨在探討Lu65和Lu99移植瘤組織中上述蛋白與功能性血管的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其移植瘤模型建立

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)日本山梨大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)[8]。雄性BALB/c品系裸鼠(BALB/c-nu/nu)40只，購于日本SLC株式會(huì)社，鼠齡為7～8周，動(dòng)物模型的建立和飼養(yǎng)均在日本山梨大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中進(jìn)行[7-9]。

1.1.2 肺癌細(xì)胞株大細(xì)胞肺癌Lu65和Lu99細(xì)胞株由日本東北大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所提供，在日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖分子教研室的細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)傳代培養(yǎng)[10]，兩種細(xì)胞株均培養(yǎng)于含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。

1.1.3 腫瘤細(xì)胞移植采用細(xì)胞培養(yǎng)移植法，先進(jìn)行Lu65和Lu99細(xì)胞培養(yǎng)并傳代，收集約5×106個(gè)細(xì)胞接種到裸鼠背部皮下，方便觀察腫瘤。接種后每周兩次使用電子天平稱量裸鼠體質(zhì)量，觀察裸鼠進(jìn)食、飲水及腫瘤的生長情況，應(yīng)用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑和短徑。計(jì)算腫瘤體積方法[8]：腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。待腫瘤體積達(dá)到1 000 mm3時(shí)進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察[8]。Lu65細(xì)胞移植后約15 d，Lu99細(xì)胞株移植后約30 d腫瘤體積達(dá)到了1 000 mm3。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器設(shè)備牙科電鉆，磁力攪拌器，低溫冰箱，轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(萊卡，RM2235)，白色透明濕盒，五片直立瓶，羅紋口玻璃瓶，防脫片，顯微鏡(奧林巴斯，BX53)。

1.2.2 主要試劑魚明膠購于Sigma公司；羊抗鼠血清蛋白和免疫球蛋白G1和M(IgG1、IgM)購自美國Bethyl Laboratories公司；兔抗人HIF-1α購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；VEGF和Ki67單克隆抗體購自邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；與一抗種屬匹配的二抗兔抗羊IgG購自美國Vector Laboratories公司；顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)試劑盒購自邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 標(biāo)本的制備

活體冷凍固定移植瘤的步驟見圖1。帶有移植瘤的裸鼠用乙醚麻醉，剪開背部皮膚暴露移植瘤，用-196℃液氮致冷的異戊烷-丙烷冷凍液(-193℃)固定移植瘤制備標(biāo)本[8]。在液氮中用牙科電鉆取下移植瘤組織后，移到-80℃干冰預(yù)冷的2%多聚甲醛-丙酮液中進(jìn)行冷凍置換[6]。冷凍置換是固定在2%多聚甲醛-丙酮液的冷凍標(biāo)本從-80℃逐漸升溫到室溫的過程。移植瘤冷凍置換后用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物或石蠟包埋劑包埋，進(jìn)行冰凍或石蠟切片，顯微鏡下觀察。本項(xiàng)目主要觀察移植瘤組織，轉(zhuǎn)移瘤不在本次研究范圍內(nèi)。

圖1 活體冷凍固定移植瘤模式圖

1.4 免疫組織化學(xué)染色

石蠟標(biāo)本3μm連續(xù)切片后貼附于含MAS的防脫載玻片。一部分切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色；另一部分切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，最后蒸餾水水化后用PBS沖洗，用于IHC染色。IHC采用親和素-生物素-過氧化物酶(ABC)法。首先用1%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，2%魚明膠溶液封閉。PBS漂洗3次，分別滴加一抗羊抗鼠血清蛋白Albumin、IgG1、IgM，兔抗人VEGF、HIF-1α和Ki67單克隆抗體，4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗后滴加二抗兔抗羊IgG或羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。DAB顯色，采用蘇木精進(jìn)行細(xì)胞核淡染，梯度酒精脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色均設(shè)空白對照(PBS)和自身陽性對照，自身陽性對照是在同一切片上與檢測的目的物對照比較。如Albumin在血管腔內(nèi)應(yīng)為陽性，IgG1和IgM在某些免疫細(xì)胞漿或血管腔內(nèi)應(yīng)為陽性，HIF-1α在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)為陽性，EGFR在紅細(xì)胞膜或某些梭形細(xì)胞漿應(yīng)為陽性，Ki67在腫瘤細(xì)胞核應(yīng)為陽性。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn)

在連續(xù)切片上對Lu65和Lu99細(xì)胞移植瘤組織(包括血管、癌間質(zhì)、癌細(xì)胞外基質(zhì))的Albumin、IgG1和IgM蛋白免疫組化染色強(qiáng)弱程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，若觀察到IgM蛋白免疫組化染色在血管腔內(nèi)和其周圍細(xì)胞外基質(zhì)呈棕黃色著色，則判定為非功能性血管；IgM蛋白免疫組化染色只是在血管腔內(nèi)，其周圍細(xì)胞外基質(zhì)無棕黃色著色，判定為功能性血管，計(jì)數(shù)功能性血管和非功能性血管數(shù)量。VEGF蛋白免疫組化染色在胞膜或細(xì)胞漿呈棕色判斷為陽性，無著色為陰性。HIF-1α在細(xì)胞核或漿呈棕色判斷為陽性，無著色為陰性。Ki67在胞核呈棕色判斷為陽性，無著色為陰性。光鏡(200倍)下選擇至少5個(gè)視野，按染色強(qiáng)度計(jì)分：無表達(dá)，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。再按陽性率計(jì)分：陽性率=陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/視野總細(xì)胞數(shù)×100%。陽性率=0，為0分；0＜陽性率＜25%，為1分；25%≤陽性率＜50%，為2分；陽性率≥50%，為3分。評估標(biāo)準(zhǔn)：將染色強(qiáng)度評分和陽性率評分相加，按1～3分記為低表達(dá)；4～6分記為高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。移植瘤組織中的功能性血管和非功能性血管數(shù)目以±s表示，組間差異比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)；HIF-1α蛋白免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)以例數(shù)及其比例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)(Fisher確切概率法)；HIF-1α、VEGF及Ki67蛋白表達(dá)評分的相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行分析；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lu65和Lu99移植瘤組織形態(tài)學(xué)觀察及HIF-1α蛋白的表達(dá)

Lu65和Lu99移植瘤組織連續(xù)石蠟切片的HE染色、HIF-1α蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2。HE染色見Lu65移植瘤組織中部分區(qū)域細(xì)胞核碎裂、胞漿呈紅染的壞死細(xì)胞形態(tài)。HIF-1α蛋白在Lu99移植瘤細(xì)胞核未見表達(dá)，呈陰性；在Lu65移植瘤組織少許腫瘤細(xì)胞核呈淺黃色著色，為低表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白在Lu65移植瘤組織中表達(dá)陽性率為100%，在Lu99移植瘤組織中表達(dá)陽性率為0，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？梢奌IF-1α蛋白表達(dá)與Lu99和Lu65移植瘤腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性有關(guān)。

圖2 Lu65和Lu99移植瘤組織HE染色和HIF-1α蛋白免疫組織化學(xué)染色后的病理組織學(xué)觀察

2.2 VEGF和Ki67蛋白在Lu65和Lu99移植瘤組織中的表達(dá)及其與HIF-1α蛋白的相關(guān)性

Lu65和Lu99移植瘤組織VEGF、Ki67蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖3。VEGF免疫組化染色在移植瘤組織周圍纖維結(jié)締組織和間質(zhì)內(nèi)某梭形細(xì)胞膜陽性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞呈陽性表達(dá)，Lu65和Lu99移植瘤細(xì)胞漿呈陽性高表達(dá)。Ki67免疫組化染色在Lu65和Lu99移植瘤核呈陽性高表達(dá)。隨機(jī)取20個(gè)Lu65和Lu99移植瘤組織石蠟標(biāo)本HIF-1α與VEGF、Ki67蛋白表達(dá)的評分采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行分析，得到HIF-1α蛋白表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)評分相關(guān)系數(shù)rs=0.042，P=0.86；HIF-1α蛋白表達(dá)與Ki67蛋白表達(dá)評分相關(guān)系數(shù)rs=0.216，P=0.361?？梢奓u65和Lu99移植瘤組織HIF-1α蛋白表達(dá)與VEGF和Ki67蛋白無明顯相關(guān)關(guān)系。

圖3 組織病理學(xué)觀察LU65和LU99移植瘤組織中VEGF和Ki67蛋白的表達(dá)

2.3 Albumin、IgG1和IgM蛋白在移植瘤組織中的表達(dá)及功能性血管數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析

Lu65和Lu99移植瘤組織HE染色和Albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖4。在HE染色的移植瘤組織中觀察到擴(kuò)張的血管及血管內(nèi)紅細(xì)胞，并且在Lu65移植瘤組織中見部分區(qū)域細(xì)胞核碎裂、胞漿呈紅染的壞死細(xì)胞形態(tài)。Albumin免疫組化染色在血管、細(xì)胞外基質(zhì)呈強(qiáng)-中度陽性。IgG1免疫組化染色在血管和癌周圍結(jié)締組織呈中度陽性，在細(xì)胞外基質(zhì)呈弱陽性。IgM免疫組化染色在血管和癌周圍纖維結(jié)締組織呈中度陽性，但是在大部分細(xì)胞外基質(zhì)呈陰性，少部分細(xì)胞外基質(zhì)呈陽性。Albumin、IgG1和IgM蛋白在Lu65移植瘤組織的片狀壞死區(qū)呈非特異性著色(細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞膜不清晰)。每張切片在200倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察血清蛋白(Albumin、IgG1、IgM)免疫組化染色表達(dá)部位，按方法中所述判斷標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)功能性血管和非功能性血管數(shù)目，結(jié)果見圖5。Lu65移植瘤組織的功能性血管數(shù)目為(7.80±1.03)條，非功能性血管數(shù)目為(1.20±0.92)條；Lu99移植瘤組織的功能性血管數(shù)目為(6.90±0.99)條，非功能性血管數(shù)目為(0.80±0.63)條。Lu65和Lu99移植瘤組織中功能性血管數(shù)目均高于非功能性血管(均為P＜0.05)。

圖4 Lu65和Lu99移植瘤組織HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖5 Lu65和Lu99移植瘤組織中功能性血管和非功能性血管數(shù)目的比較

3 討論

LCLC已被世界衛(wèi)生組織列為重要肺癌亞型[11]，其發(fā)病率較其他類型的肺癌為低，誤診率高，且預(yù)后較差。LCLC預(yù)后差的主要原因是腫瘤細(xì)胞的快速生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤微血管形成在LCLC細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用[12]。腫瘤血管生成與血管生成因子(VEGF和HIF-1α等)密切相關(guān)。我們研究證明了Lu99和Lu65移植瘤組織VEGF強(qiáng)陽性區(qū)域的血管壁不能透過大分子IgM，發(fā)現(xiàn)了NSCLC(包括LCLC)組織的功能性血管，并且功能性血管通透能力與血清蛋白相對分子質(zhì)量密切相關(guān)[8]。HIF-1α是HIF-1的一個(gè)活性亞基，是含有堿性的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)構(gòu)型和Per/Amt/Sim(PAS)結(jié)構(gòu)的異源性二聚體(bHLH-PAS)，是第1個(gè)被證實(shí)參與VEGF轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤血管生成等密切相關(guān)[13]。在非小細(xì)胞肺癌中，HIF-1α蛋白表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌和腺癌組織的血管形成密切相關(guān)[4]。在前列腺癌組織中HIF-1α蛋白表達(dá)與腫瘤惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)，分化差(高級別)的前列腺癌組織中高表達(dá)HIF-1α蛋白，并且VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)[14-15]。另外，HIF-1α還與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，HIF-1α陰性患者的病理完全緩解率顯著高于HIF-1α陽性患者[16]。在這些腫瘤中，HIF-1α的過度表達(dá)可能與腫瘤缺氧性質(zhì)、HIF-1α異常激活、腫瘤高度侵襲性有關(guān)[17]。本研究顯示Lu65移植瘤組織的HIF-1α低表達(dá)，Lu99移植瘤組織細(xì)胞不表達(dá)。另外，移植瘤組織間質(zhì)的淋巴細(xì)胞和某些巨噬細(xì)胞HIF-1α蛋白陽性表達(dá)，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相同[18]。在Lu99和Lu65移植瘤組織中HIF-1α蛋白不表達(dá)或低表達(dá)與VEGF和Ki67蛋白是否表達(dá)及腫瘤細(xì)胞壞死形態(tài)無明顯相關(guān)。統(tǒng)計(jì)分析HIF-1α蛋白在Lu99和Lu65移植瘤組織的表達(dá)量，不僅在不同細(xì)胞株(Lu65和Lu99)移植瘤組織之間有差異，而且在相同細(xì)胞株(Lu65)移植瘤組織之間有差異，故我們推測在Lu99和Lu65移植瘤組織中HIF-1α蛋白表達(dá)有可能與腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性有關(guān)。

本課題組此前研究報(bào)道了A549移植瘤侵襲組織與不同分子質(zhì)量血清蛋白(Albumin、IgG1、IgM)表達(dá)有關(guān)[19]，還與Ki67蛋白表達(dá)有關(guān)，但是與VEGF和EGFR表達(dá)無明顯相關(guān)[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織的功能性血管通透性與血清蛋白的分子質(zhì)量密切相關(guān)[7-9]，包括LCLC(Lu65和Lu99)組織。大多數(shù)研究報(bào)道認(rèn)為腫瘤血管生成與HIF-1α蛋白密切相關(guān)[14，21]。本研究采用報(bào)道[19，22]的半定量統(tǒng)計(jì)分析方法，對Lu65和Lu99細(xì)胞株移植瘤血清蛋白免疫組化染色強(qiáng)度進(jìn)行了半定量分析，發(fā)現(xiàn)功能性血管與非功能性血管的周圍移植瘤間質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)中的血清蛋白(IgG、IgM)呈不同強(qiáng)度表達(dá)，說明了Lu65和Lu99細(xì)胞株移植瘤組織的血管通透性與血清蛋白相對分子質(zhì)量和血管結(jié)構(gòu)有關(guān)，也可能與VEGF蛋白表達(dá)強(qiáng)弱有關(guān)[8]，但是與HIF-1α蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)。另外，本研究首次發(fā)現(xiàn)了Lu65和Lu99細(xì)胞株移植瘤組織的功能性血管數(shù)目高于非功能性血管的研究成果，這一結(jié)果可能對腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療有重大意義。

綜上所述，IVCT技術(shù)制備的Lu65和Lu99細(xì)胞株移植瘤石蠟標(biāo)本采用免疫組化染色分析HIF-1α、VEGF、Ki67和血清蛋白Albumin、IgG1、IgM的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白表達(dá)與VEGF、Ki67蛋白表達(dá)和腫瘤組織壞死形態(tài)無明顯關(guān)，與Lu65和Lu99移植瘤細(xì)胞異質(zhì)性有關(guān)。根據(jù)血清蛋白Albumin、IgG1、IgM的免疫組化染色表達(dá)強(qiáng)弱程度，提出功能性血管和非功能性血管的觀點(diǎn)，并且Lu65和Lu99移植瘤組織中功能血管數(shù)目高于非功能血管。移植瘤組織的血管通透性與血清蛋白Albumin、IgG、IgM的相對分子質(zhì)量和血管結(jié)構(gòu)有關(guān)。

(感謝日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖分子組織學(xué)教研室大野教授大力支持)