Cystatin 6蛋白在哈薩克族食管鱗癌組織中的表達(dá)及其意義

李子垚，張海平，買地尼也提·尼亞孜，居來(lái)提·艾尼瓦爾，張力為，伊地力斯·阿吾提，，

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，新疆 烏魯木齊 830054；2．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

食管癌為全球十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分居全球第7位和第6位，且因高侵襲性和低存活率使其成為了最致命的癌癥之一[1]。根據(jù)組織學(xué)類型可將食管癌分為鱗癌和腺癌，我國(guó)大多為食管鱗狀細(xì)胞癌，且發(fā)病率逐年增加[2-3]。新疆地處伊朗至我國(guó)北中部的食管癌高危地帶，食管癌的發(fā)病具有顯著的種族和地域差異性，以哈薩克族人群發(fā)病率最高[4-5]。人型半胱氨酸蛋白酶抑制cystatin 6(cystatin M/E，CST6)是一種蛋白水解酶抑制劑，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，其表達(dá)水平的高低以及活性強(qiáng)弱，對(duì)維持蛋白水解的平衡具有重要意義。有研究報(bào)道CST6參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，最初被認(rèn)為是乳腺癌中的新型腫瘤抑制基因[6]。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，因其具有雙重結(jié)合位點(diǎn)的特性，所以表現(xiàn)出促癌或抑癌兩種完全不同的作用[7-8]。該基因在乳腺癌、宮頸鱗癌[9]、皮膚鱗狀細(xì)胞癌[10]、黑色素瘤、肺癌、腦頸部癌、前列腺癌、胃癌和腎癌中表現(xiàn)出腫瘤抑制效應(yīng)。有報(bào)道提出在與乳腺癌和口腔鱗癌中某些半胱氨酸組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和CSTL)的異常表達(dá)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的蛋白水解途徑產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而被認(rèn)為是一種腫瘤促進(jìn)基因[11-12]。其在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床病理意義尚不明確，在食管癌高發(fā)民族哈薩克族中尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。此研究將探討CST6在哈薩克族食管鱗癌患者癌組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)及其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 患者資料

選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科2010年12月—2020年12月行食管癌根治術(shù)，并且具有隨訪記錄的55例哈薩克族食管鱗癌患者，隨訪時(shí)間從患者出院開(kāi)始追蹤至患者死亡，按照月數(shù)納入本研究。其中男性32例，女性23例；年齡32～74歲，平均年齡(61.64±8.46)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理證實(shí)為鱗癌；②切緣病理檢查示陰性；③有明確的病理分期；④完整的隨訪記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受放、化療等其他特殊治療。收集患者的癌組織和癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)。組織學(xué)分類、分化程度以及術(shù)后詳細(xì)病理分期根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第八版分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類[13]。術(shù)后病理分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期31例，Ⅲ期15例。本研究通過(guò)了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)K201911-02)，取得了所有患者及家屬的知情同意。

1.2 免疫組化分析

采用免疫組織化學(xué)Envision二步法檢測(cè)癌組織和癌旁組織中CST6蛋白的表達(dá)。CST6兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔二步法檢測(cè)試劑盒(PV6001)購(gòu)自北京中杉金橋公司。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、用檸檬酸抗原修復(fù)液抗原修復(fù)、滴加一抗(1：300稀釋)，于4℃過(guò)夜后次日滴加二抗、DAB顯色(3 min)、蘇木素復(fù)染、脫水及封片。鏡檢采用雙盲法，由2名高年資病理科醫(yī)師完成，每張切片均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(×400)。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例來(lái)定：①陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按照無(wú)著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別計(jì)分為0、1、2、3分；②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目按照0、＞0～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%～100%分別計(jì)分為0、1、2、3、4分。兩個(gè)分?jǐn)?shù)相加得到總的染色分?jǐn)?shù)，0～3分定義為低表達(dá)，4～7分定義為高表達(dá)，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)(當(dāng)理論頻數(shù)＜5時(shí)，應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)法)。采用Kaplan-Meier單因素法和COX多因素回歸進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CST6蛋白的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖1。CST6蛋白的表達(dá)在哈薩克族食管鱗癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜以及角化區(qū)(少部分細(xì)胞核中有表達(dá))，且在同一患者的癌組織中分化程度較高的區(qū)域陽(yáng)性程度更高，在癌旁組織中高表達(dá)水平僅限于分化層。55例食管鱗癌標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中CST6陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.4%(20/55)和61.8%(34/55)，與癌旁正常組織比較，癌組織中CST6陽(yáng)性表達(dá)率降低(P=0.036)。

圖1 免疫組織化學(xué)Envision法檢測(cè)CST6蛋白的表達(dá)情況

2.2 CST6蛋白表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

CST6蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見(jiàn)表1。CST6蛋白的表達(dá)與家族史(χ2=5.595，P=0.045)和腫瘤分化程度(χ2=4.420，P=0.036)有關(guān)。CST6蛋白的表達(dá)情況在無(wú)腫瘤家族史、有食管鱗癌家族史以及非食管鱗癌家族史這3組患者中的表達(dá)有明顯差異，無(wú)腫瘤家族史患者其CST6蛋白的表達(dá)程度更高；在腫瘤高分化患者中蛋白的表達(dá)水平高于低/中分化患者。與性別、年齡、吸煙史、飲酒史、神經(jīng)脈管侵犯、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后病理分期等臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)(均為P＞0.05)。

表1 CST6的蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 食管鱗癌患者的生存率與CST6蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Kaplan-Meier生存率的分析結(jié)果顯示，CST6高表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為50.6個(gè)月，而低表達(dá)患者為22.3個(gè)月。兩組患者的生存曲線見(jiàn)圖2，CST6蛋白的表達(dá)水平與患者生存率有關(guān)(χ2=0.032，P=0.003)。食管癌患者預(yù)后影響的單因素分析結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)CST6蛋白的表達(dá)水平、浸潤(rùn)深度以及術(shù)后病理分期與食管鱗癌患者的預(yù)后相關(guān)(P＜0.05)。

表2 食管癌患者預(yù)后影響的單因素分析

圖2 食管鱗癌患者的生存曲線

食管癌患者預(yù)后影響的多因素分析結(jié)果見(jiàn)表3。把單因素分析中有意義的因素，結(jié)合本課題組以往研究結(jié)果所認(rèn)為的影響預(yù)后的相關(guān)因素一起，進(jìn)一步納入到COX多因素生存分析中，結(jié)果顯示，CST6蛋白陰性表達(dá)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤低分化程度是食管鱗癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)。

表3 食管癌患者預(yù)后影響的多因素分析

3 討論

食管癌的發(fā)生發(fā)展是多種基因及蛋白參與并相互作用的分子生物學(xué)過(guò)程。當(dāng)腫瘤抑制基因變異時(shí)，細(xì)胞分裂變快，穩(wěn)定性遭破壞，細(xì)胞增生調(diào)控紊亂，克隆生長(zhǎng)加快，直至腫瘤形成[14-15]。CST6在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表現(xiàn)為腫瘤抑制效應(yīng)，Boman[16]的研究認(rèn)為皮膚上皮組織受到刺激最終導(dǎo)致皮膚癌變(皮膚鱗癌)的發(fā)生。借此我們將食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展與其在物理層面上食管黏膜受到“刺激”后其上皮組織會(huì)表達(dá)多種與先天免疫系統(tǒng)相關(guān)的蛋白相關(guān)聯(lián)。CST6是進(jìn)化相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，對(duì)溶酶體半胱氨酸蛋白酶有特異性抑制作用[17]。半胱氨酸蛋白酶在體外參與結(jié)締組織和基底膜組分的降解，機(jī)體因?yàn)檫@些蛋白酶的異常表達(dá)以及活性的改變而發(fā)生腫瘤侵襲[18-21]。當(dāng)過(guò)量的CST6與參與腫瘤生長(zhǎng)、遷徙、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的半胱氨酸組織蛋白酶(如組織蛋白酶B)相作用，CST6的表達(dá)保護(hù)了機(jī)體其他具有免疫功能相關(guān)的蛋白，平衡細(xì)胞的增殖和凋亡，發(fā)揮了其在非食管癌患者中的特定保護(hù)作用[22]。當(dāng)?shù)鞍姿夤δ苁Ш?，有癌變傾向的細(xì)胞不能被及時(shí)清除，食管癌變可能就此發(fā)生。CST6基因的抑癌作用除了可以用蛋白水解酶的平衡性來(lái)解釋外，Lalmanach等[23]的研究發(fā)現(xiàn)人工合成的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(E-64)對(duì)細(xì)胞增殖和內(nèi)皮黏附無(wú)顯著影響，因此CST6可能通過(guò)抑制組織蛋白酶以外的其他機(jī)制或者是通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮腫瘤抑制作用。CST6在腦膠質(zhì)瘤和原發(fā)性腦腫瘤中被鑒定為甲基化敏感基因[24-25]，因此CST6的甲基化可能使該基因發(fā)生表觀沉默從而促使腫瘤的發(fā)生，借此我們推測(cè)食管鱗癌的發(fā)生也可能與CST6基因的表觀修飾

有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織CST6蛋白的表達(dá)水平低于癌旁組織，陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.4%和61.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)，與Zeeuwen等[22]的研究結(jié)果相一致。此外，無(wú)腫瘤家族史的患者CST6蛋白表達(dá)明顯高于有腫瘤家族史的患者，同時(shí)CST6的陽(yáng)性表達(dá)率具有隨著腫瘤分化程度的增高而升高的趨勢(shì)，與家族史(P=0.045)和腫瘤分化程度(P=0.036)相關(guān)。食管癌變極早期階段已發(fā)生細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞主要位于增生活躍的基底細(xì)胞群中，而本實(shí)驗(yàn)免疫組化的結(jié)果顯示在癌旁組織中食管上皮的分化層細(xì)胞CST6蛋白的陽(yáng)性表達(dá)高于基底層細(xì)胞，所以CST6可能不能作為極早期食管鱗癌的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，為此我們進(jìn)一步探索CST6表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后的關(guān)系。在生存率的分析中CST6陽(yáng)性表達(dá)的患者平均生存時(shí)間高于陰性表達(dá)的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。而單因素及多因素分析結(jié)果均提示食管鱗癌組織中CST6蛋白的低表達(dá)是其不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，CST6蛋白低表達(dá)可能是哈薩克族食管鱗癌患者中的腫瘤危險(xiǎn)因素，與其發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)，且可能成為在預(yù)后判斷中具有重要意義的生物標(biāo)志物之一。我們擬擴(kuò)大樣本量，并增加與漢族的對(duì)照樣本，繼續(xù)對(duì)其在不同民族樣本中的組織表達(dá)水平進(jìn)行臨床病理學(xué)分析，并進(jìn)一步對(duì)CST6基因表觀遺傳學(xué)變異及其在食管鱗癌不良預(yù)后的調(diào)控分子機(jī)制層面進(jìn)行深入研究，為食管鱗癌患者的診斷、治療以及預(yù)后發(fā)掘出新的視角。