沉默乙酰肝素酶聯(lián)合那屈肝素對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

莊喜兵，袁素娟，張 琪，呂名鶴，程韻楓，喬田奎

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤診斷與治療中心，上海 201508)

肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種β-D-葡萄糖醛酸苷酶，能夠識(shí)別和切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)鏈，從而參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解和重構(gòu)[2]。HPA還能促進(jìn)幾種與HS相關(guān)分子的釋放和擴(kuò)散，如生長因子、趨化因子、形態(tài)因子和酶，這些分子對(duì)腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要[2]。此外，HPA的表達(dá)在幾乎所有類型癌癥中均高表達(dá)，提示HPA可能成為肺癌治療的分子靶點(diǎn)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn) 化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一個(gè)正常的生理過程，上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)分化，其特征是去極化、細(xì)胞-細(xì)胞間接觸消失和纖維母細(xì)胞樣形態(tài)延長，在癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[3]。EMT的生物學(xué)特性已經(jīng)明確為上皮標(biāo)記物的丟失，如E-cadherin和細(xì)胞角蛋白，以及間充質(zhì)標(biāo)記物的獲得，如波形蛋白和纖維連接蛋白[4]。EMT是由多種信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和激活介導(dǎo)的，包括轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生長因子、Wnt、Sonic Hedgehog、Notch和整合素等[5-6]。已有研究[7-8]表明，肺癌轉(zhuǎn)移和放化療耐藥與EMT密切相關(guān)。此外，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可以通過EMT獲得腫瘤干細(xì)胞樣表型[9]。低分子量肝素是預(yù)防和治療血栓形成的有效抗凝劑，其結(jié)構(gòu)與HS蛋白多糖的側(cè)鏈相似，可以競爭性抑制HPA活性，通過抑制HPA影響選擇素生成，抑制細(xì)胞黏附和腫瘤血管生成發(fā)揮抗癌作用，并與細(xì)胞周期和凋亡有關(guān)[10]。為探討HPA與EMT之間的關(guān)系，本研究旨在探索慢病毒介導(dǎo)內(nèi)源性HPA的沉默與外源性那屈肝素(nadroparin)抑制HPA活性，兩者聯(lián)合對(duì)抑制A549細(xì)胞生長的作用及其潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系人肺腺癌A549細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，用含10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞傳代至指數(shù)生長期使用。

1.1.2 主要試劑靶向HPA的3種不同序列及陰性對(duì)照短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)的慢病毒載體由南京凱基生物有限公司設(shè)計(jì)合成，序列分別為：陰性對(duì)照shRNA，5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTCT-3′；shRNA1，5′-GCTCTGTAGATGTGCTATACA-3′；shRNA2，5′-GCAATGAACCTAACAGTTTCC-3′；shRNA3，5′-GCAAGCGTGCAAGGTTCAAAG-3′。慢病毒轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑凝聚胺(polybrene)購于南京凱基生物有限公司。嘌呤霉素購自EMD Millipore公司。那屈肝素由葛蘭素史克生產(chǎn)，商品名為速碧林。CCK-8試劑盒購于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，用于檢測細(xì)胞增殖。ELISA試劑購于R&D Systems，用于檢測培養(yǎng)上清中TGF-β1的濃度。基質(zhì)膠Matrigel和transwell室購自BD公司。RNA快速提取試劑盒購于上海奕杉生物科技有限公司。Prime ScriptRTMaster mix和SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa生物科技有限公司。兔抗HPA、TGF-β1、磷酸化Smad2/3、鋅指E盒結(jié)合同源框1(ZEB-1)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子SNAIL、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、N鈣黏蛋白(N-cadherin)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)購于瑞昊生物科技有限公司。兔抗TWIST多克隆抗體購自Cell Signaling Technology(CST)公司。山羊抗兔HRP二抗和小鼠抗GAPDH單抗購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染建立HPA沉默的A549細(xì)胞株及驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)5組，分別為空白對(duì)照組（A549細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA序列）、轉(zhuǎn)染HPA shRNA1/2/3共3個(gè)沉默組。將指數(shù)生長期A549細(xì)胞按2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中。置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞，加入慢病毒感染細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)=10)，同時(shí)加入2.5μg聚凝胺以增強(qiáng)感染效率。感染48 h后，用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定沉默HPA的A549細(xì)胞株，流式細(xì)胞術(shù)檢測帶GFP熒光的細(xì)胞比例以觀察病毒感染效率。收集各組細(xì)胞，RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptTMRT Master反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA樣品。引物序列由上海生工生物有限公司合成，HPA引物序列：上游5′-TCCTGCGTACCTGAGGTTTG-3′；下游5′-CCATT CCAACCGTAACTTCTCCT-3′。β-actin引物序列：上游5′-GTCTGCCTTGGTAGTGGATAATG-3′；下 游：5′-TCGAGGACGCCCTATCATGG-3′。采用常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測細(xì)胞HPA mRNA表達(dá)量。同時(shí)用Western blot檢測HPA蛋白表達(dá)水平。主要步驟如下：8%SDS-PAGE分離各組細(xì)胞總蛋白并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)。用含5%脫脂牛奶的TBST在室溫下封閉1 h，用抗HPA一抗(1∶1 000稀釋)，4°C下孵育過夜，GAPDH抗體作為內(nèi)參，TBST洗膜3次，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)。PVDF膜用TBST再次洗滌，蛋白條帶用超敏發(fā)光液(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate，EMD Millipore)顯影，Tanon-4500凝膠成像系統(tǒng)和GIS ID分析軟件v4.1.5(Tanon科技有限公司)進(jìn)行半定量分析。以驗(yàn)證慢病毒感染效果，篩選出最佳慢病毒序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 抑制實(shí)驗(yàn)分組

抑制實(shí)驗(yàn)按處理方式不同，共設(shè)6個(gè)組：空白對(duì)照組(A549細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照HPA shRNA序列的A549細(xì)胞)、沉默HPA(轉(zhuǎn)染shRNA3的A549細(xì)胞)組、空白對(duì)照+那屈肝素組、陰性對(duì)照+那屈肝素組、shRNA+那屈肝素聯(lián)合組，那屈肝素濃度為100 U/mL，培養(yǎng)體系2 mL，總劑量200 U，處理48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力

將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h。按1.3分組處理后加入CCK-8試劑(10μL/孔)，37℃下孵育1 h，在450 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度，按下式計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=D(450)處理組/D(450)空白對(duì)照組×100%

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度測定

細(xì)胞接種于6孔板，密度約為2×105個(gè)/孔，按1.3分組處理后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，使用ELISA試劑盒(R&D Systems，Inc.)說明書操作測定TGF-β1濃度。

1.6 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞處理同1.3，取2×104個(gè)處理后的細(xì)胞接種于transwell上室，加入200μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，并將上室置于500μL含15%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基的下室中培養(yǎng)48 h，然后加0.1%結(jié)晶紫在室溫下染色30 min，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察穿過上室的細(xì)胞。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，transwell上室預(yù)涂基質(zhì)膠，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分析使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics公司)。

1.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白

細(xì)胞處理方法同1.3，收集細(xì)胞后用8%～10%SDS-PAGE分離各組細(xì)胞總蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜。所用抗TGF-β1、磷酸化-Smad2/3、ZEB-1、SNAIL、TWIST、E-cadherin、N-cadherin和MMP-2，一抗和二抗稀釋比例均為1∶1 000，具體操作步驟同1.2。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示。Student-t檢驗(yàn)用于比較兩組之間的差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPA沉默A549細(xì)胞株的建立

慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，經(jīng)嘌呤霉素篩選，在熒光顯微鏡下可以看到感染細(xì)胞呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的綠色熒光，流式細(xì)胞術(shù)檢測不同shRNA的效率在80%～99%之間(圖1)。qPCR分析顯示，與空白對(duì)照組相比，3種不同的shRNA均不同程度地沉默HPA的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且shRNA3組HPA mRNA表達(dá)下調(diào)至21%(t=359.594，P＜0.01，圖2A)；Western blot結(jié)果顯示，shRNA3組HPA蛋白表達(dá)顯著降低(t=90.780，P＜0.01，圖2B)?？梢钥吹剑瑂hRNA3沉默HPA的效果最強(qiáng)，因此選擇shRNA3轉(zhuǎn)染構(gòu)建的A549細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效果

圖2 HPA沉默效果驗(yàn)證(n=3)

2.2 HPA沉默聯(lián)合那屈肝素抑制A549細(xì)胞活力

CCK-8法檢測HPA沉默加或不加那屈肝素處理后A549細(xì)胞的活力。結(jié)果如圖3所示，與空白對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組未抑制細(xì)胞活力，單獨(dú)那屈肝素處理或HPA沉默可使細(xì)胞活力下降(P＜0.05)，而兩者聯(lián)合抑制A549細(xì)胞增殖的作用更為顯著(P＜0.05)。具體從細(xì)胞活力值來看，聯(lián)合組細(xì)胞活力只有空白對(duì)照組的48.92%，空白+那屈肝素組為83.45%，陰性對(duì)照+那屈肝素組為83.08%，聯(lián)合組與后兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 沉默HPA和/或那屈肝素對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

2.3 HPA沉默聯(lián)合那屈肝素抑制A549細(xì)胞TGF-β1表達(dá)

TGF-β通路是EMT過程中的核心信號(hào)通路之一[11]。與空白對(duì)照和陰性對(duì)照組相比，ELISA檢測結(jié)果顯示在A549細(xì)胞中沉默HPA或經(jīng)那屈肝素處理后TGF-β1水平明顯降低(圖4A，P＜0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)HPA沉默和那屈肝素均可下調(diào)細(xì)胞TGF-β1蛋白的表達(dá)，聯(lián)合處理抑制效果更明顯(圖4B，P＜0.05)。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)液TGF-β1濃度及A549細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

2.4 HPA沉默聯(lián)合那屈肝素抑制A549細(xì)胞遷移與侵襲能力

細(xì)胞的遷移和侵襲對(duì)體內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，單獨(dú)HPA沉默或那屈肝素均抑制了細(xì)胞的遷移能力(P＜0.05)。與其他組相比，聯(lián)合組抑制細(xì)胞遷移效果最顯著(P＜0.05)。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果。綜合上述結(jié)果表明，HPA沉默抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而聯(lián)合那屈肝素處理則增強(qiáng)了這種抑制作用，具有協(xié)同作用，見圖5。

圖5 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

2.5 HPA沉默聯(lián)合那屈肝素抑制TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

見圖6。與空白對(duì)照組比較，那屈肝素單獨(dú)處理可抑制A549細(xì)胞中SNAIL、TWIST和N-cadherin的表達(dá)水平，而E-cadherin的表達(dá)則增加(P＜0.05)。p-Smad2/3、ZEB-1和MMP-2表達(dá)水平未見明顯變化(P＞0.05)。此外，與空白對(duì)照組比較，單獨(dú)HPA沉默A549細(xì)胞中p-Smad2/3、ZEB-1、SNAIL、TWIST、N-cadherin和MMP-2的表達(dá)水平降低(P＜0.05)，同時(shí)E-cadherin的表達(dá)水平升高(P＜0.05)，兩者聯(lián)合作用差異更顯著(P＜0.05)。見圖7。

圖6 Western blot檢測TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖7 TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

乙酰肝素酶(HPA)在腫瘤進(jìn)展、促凝活性、子癇前期和炎癥等多個(gè)病理過程中發(fā)揮著重要作用，并對(duì)硫酸乙酰肝素的降解有影響[12]。硫酸乙酰肝素降解過程中肝素結(jié)合生長因子的釋放會(huì)影響腫瘤微環(huán)境，從而影響基因表達(dá)，并通過與跨膜蛋白相互作用增強(qiáng)自噬、轉(zhuǎn)移以及血管生成[13]。多項(xiàng)臨床研究表明，HPA活性升高與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移增強(qiáng)和預(yù)后不良相關(guān)[14-15]。相反，抑制HPA則與抑制腫瘤有關(guān)。Lou等[16]研究表明，從牛蒡子中提取的HPA抑制劑arctigenin可下調(diào)HPA的表達(dá)，抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)起源于胚胎學(xué)，以改變細(xì)胞表型為特征，影響腫瘤的致瘤性過程，尤其是在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[17-18]。文獻(xiàn)[19]報(bào)道，EMT可導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞的發(fā)展，并與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和放化療耐藥性相關(guān)。腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞之間的相互作用可以通過自身和/或旁分泌介質(zhì)，如生長因子、細(xì)胞因子和ECM蛋白，誘導(dǎo)EMT[20]。Shah等[21]報(bào)道HPA表達(dá)與EMT相關(guān)分子基因表達(dá)在胃印戒細(xì)胞腺癌組織中是一致的。因此，我們推測HPA活性與EMT密切相關(guān)。然而，HPA和EMT之間的確切聯(lián)系仍不清楚。

那屈肝素與HS蛋白多糖的HS側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似，可以競爭性抑制HPA活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，那屈肝素在抑制細(xì)胞活力、侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[22]，這也是本研究給藥的依據(jù)。本研究通過干擾HPA合成，并用那屈肝素處理抑制HPA的活性，證明聯(lián)合處理在體外具有協(xié)同抗腫瘤作用，顯著抑制了細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力。

為了進(jìn)一步探索那屈肝素抗腫瘤作用的分子機(jī)制，本文觀察A549細(xì)胞處理后EMT過程相關(guān)分子的變化。EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和激活與多種信號(hào)通路相關(guān)，TGF-β信號(hào)是與EMT相關(guān)的特征性信號(hào)通路[23]。TGF-β配體與相應(yīng)的受體(TGFβR2和TGFβR3)結(jié)合，導(dǎo)致I型受體(TGFβR1)磷酸化，這需要轉(zhuǎn)錄因子Smad2和Smad3參與，Smads被磷酸化，從而激活轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)編碼EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，包括SNAIL、TWIST和ZEB-1[24]。這些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致上皮標(biāo)記物(如E-cadherin和occludens 1)的表達(dá)或功能喪失，以及間充質(zhì)標(biāo)記物(如N-cadherin、vimentin、纖維連接蛋白和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白)和蛋白酶(如MMP-2/9)的增加[25]。有關(guān)低分子肝素與EMT之間的關(guān)系研究較少，Ponert等[26]發(fā)現(xiàn)低分子肝素減少胰腺和前列腺癌細(xì)胞中血小板誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，但具體機(jī)制未深入研究；Zhong等[27]報(bào)道了Fraxiparine可以通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路調(diào)控CXCL12-CXCR4軸抑制肺癌細(xì)胞活性。本研究為探索那屈肝素與EMT之間的關(guān)系及其可能的調(diào)控機(jī)制，檢測了HPA沉默和/或那屈肝素處理后A549細(xì)胞中TGF-β1的分泌和表達(dá)，結(jié)果表明兩者均抑制了TGF-β1的分泌和表達(dá)，尤其是在聯(lián)合處理組這種作用更顯著。值得注意的是，TGF-β1表達(dá)下調(diào)，磷酸化Smad2/3水平降低，相應(yīng)下游EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB-1、SNAIL和TWIST的表達(dá)也出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，E-cadherin上調(diào)，N-cadherin和MMP-2表達(dá)的下調(diào)。而且，那屈肝素單獨(dú)處理抑制了SNAIL和TWIST的表達(dá)水平，而ZEB-1的表達(dá)并無明顯變化。此外，HPA沉默抑制了SNAIL、TWIST和ZEB-1的表達(dá)水平，而聯(lián)合處理組卻未表現(xiàn)出增強(qiáng)的抑制，這表明可能有其他因素參與了這些重要轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。HPA沉默和那屈肝素誘導(dǎo)的這些分子表達(dá)水平的變化導(dǎo)致了協(xié)同抗腫瘤作用，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞活力、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了HPA在A549細(xì)胞惡性行為中的重要性，并表明沉默HPA與聯(lián)合那屈肝素處理對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有協(xié)同抗腫瘤作用。其分子機(jī)制可能與TGF-β1表達(dá)的下調(diào)有關(guān)，TGF-β1下調(diào)磷酸化的Smad2/3以及參與調(diào)控EMT的3個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子ZEB-1、SNAIL和TWIST的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致抑制間充質(zhì)標(biāo)記物(N-cadherin和MMP-2)的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了上皮標(biāo)記物(E-cadherin)的表達(dá)。因此，通過HPA沉默聯(lián)合那屈肝素抑制EMT過程可能為肺癌治療提供一種新的策略。然而，還需要包括體內(nèi)動(dòng)物模型和其他潛在的信號(hào)通路的進(jìn)一步研究，以驗(yàn)證HPA聯(lián)合那屈肝素的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制。