傅里葉紅外光譜快速鑒定香蕉枯萎病方法的建立

王小虎 蘭寶鋒 韋圣博 何雙 周禮芹

(廣西科學院，廣西 南寧 530007)

引言

香蕉(Musa nana Lour)是一種大型的草本植物，屬芭蕉科芭蕉屬，起源于東南亞和西太平洋，在國內主要分布于廣西、廣東、云南、海南以及臺灣等地[1]。香蕉肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，與蘋果、柑橘以及葡萄并稱世界4大水果，深受人們的喜愛。此外，在全球作物種植面積中，香蕉與小麥、玉米水稻以及水稻并稱世界4大糧食作物[2]，香蕉產量位居第1，成為世界上第1大貿易水果[3]。

香蕉產業(yè)作為一種支柱性產業(yè)，在廣西特色農業(yè)經濟發(fā)展中起著至關重要的作用[4]，然而，隨著香蕉產業(yè)的快速發(fā)展，其面臨的挑戰(zhàn)也日益艱巨，尤其是香蕉枯萎病的防治。香蕉枯萎病又稱巴拿馬病或香蕉黃葉病[5]，是由尖孢鐮刀菌古巴轉化型(Fusarium oxysporum f.sp cubense race 4,Foc TR4)侵染香蕉的維管束組織導致組織壞死腐爛的一種毀滅性病害[6]。由于香蕉枯萎病是一種土傳性病害，隨著疾病的蔓延，其產量損失可高達100%，嚴重影響香蕉產業(yè)的發(fā)展。值得注意的是，自2006年于廣西發(fā)現(xiàn)的首例香蕉枯萎病至今，香蕉枯萎病一直呈現(xiàn)蔓延的趨勢，且在近幾年呈指數型增長，導致香蕉的種植面積大幅度降低，甚至出現(xiàn)土地被迫荒廢或改種其他農作物等情況[7]。因此，亟需一種安全、高效、經濟的檢測方法對香蕉枯萎病進行檢測，從而盡快恢復香蕉產業(yè)的發(fā)展。

傅里葉紅外光譜法(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR)是由分子基團振動而形成的振動吸收光譜[8]，常用于物質的定性與定量分析[9]。由于其具有操作簡便、靈敏度高以及所需樣品量少等特點，已被廣泛運用于生物、食品和化學等領域。本研究主要利用傅里葉紅外光譜法對健康的香蕉葉片以及患香蕉枯萎病的香蕉葉片進行檢測分析，為準確、高效地鑒定香蕉枯萎病提供一種安全可靠的檢測方法，也為其它病蟲害的檢測提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為廣西農業(yè)科學院試驗田的巴西蕉葉片。

1.2 儀器設備和測試條件

實驗儀器主要包括Thermo Scientific 公司Nicolet iS10型傅立葉變換紅外光譜，Millipore超純水儀器，SPS402電子天平，高速粉碎機，壓片機，電熱鼓風干燥箱。其中，傅立葉變換紅外光譜儀光譜范圍為4000～400cm-1，信號掃描累加次數32次[10]，光譜分辨率為4cm-1。

1.3 樣品處理

取4株健康的香蕉葉片與4株患香蕉枯萎病的香蕉葉片分別進行烘箱干燥，取適量樣品于高速粉碎機中粉碎，隨后轉入瑪瑙缽中研磨，研磨均勻后進行壓片，最后于傅里葉紅外光譜儀中進行檢測，樣品各重復3次。

1.4 數據處理

利用OMNIC 9.0軟件將采集的紅外光譜信息進行吸光度、自動基線校準、平滑9.0和二階導數處理，保存為TIF和CSV格式。將導出的CSV數據劃分成900～1100cm-1、1100～1400cm-1以及2800～3000cm-13個波段，將其分別導入PAST 3.0軟件進行PCA和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 健康與患病香蕉葉的紅外光譜分析

2.1.1 健康香蕉葉紅外光譜分析

由圖1可知，4株健康香蕉葉的紅外光譜圖在波形上極其相似，其吸收峰的位置、數量以及大小也大致相同。值得注意的是，健康香蕉葉主要包含8個吸收峰，其波長依次為1031cm-1、1416cm-1、1462cm-1、1594cm-1、1734cm-1、2848cm-1、2916cm-1、3325cm-1。其中，在1031cm-1處形成一個強而寬的吸收峰，為多糖C-O-C的伸縮振動[11]；1416cm-1附近的吸收峰主要來自酚類物質中甲基的C-H的對稱彎曲振動[12]；1462cm-1主要為-CH2-的伸縮振動[13]；1594cm-1附近形成一個較寬的吸收峰，主要為苯環(huán)上C=C骨架的伸縮振動[14]；1734cm-1附近形成1個尖銳的吸收峰，主要為苯環(huán)上C=O的伸縮振動[15]；2848cm-1和2916cm-1附近形成2個極其尖銳的吸收峰，為C-H的反對稱伸縮振動吸收峰；3325cm-1附近形成的寬吸收峰為-OH的伸縮振動[16]。

圖1 4株健康香蕉葉的紅外光譜圖

2.1.2 枯萎病香蕉葉的紅外光譜分析

由圖2可知，枯萎病香蕉葉的紅外光譜圖在波形上大致相似，但仍存在些許差異。枯萎病香蕉葉主要包含9個吸收峰，分別位于1030cm-1、1166cm-1、1317cm-1、1462cm-1、1612cm-1、1734cm-1、2847cm-1、2915cm-1、3214cm-1處。其中，在3214cm-1附近存在的寬而弱的吸收峰，為-OH的伸縮振動；2915cm-1和2847cm-1處形成的尖銳吸收峰為甲基和亞甲基的反對稱伸縮振動與對稱伸縮振動[17]；1734～1462cm-1的吸收峰主要為酰胺和羧基振動區(qū)，其中1612cm-1處的吸收峰為蛋白質酰胺Ⅰ帶吸收[18]，同時還可能含有多糖的吸收[17]；1317cm-1處為C-H的剪切式振動；1030cm-1處形成的強吸收峰為多糖的C-O-C伸縮振動[11]。

2.2 健康香蕉葉與枯萎病香蕉葉的紅外光譜比較

如圖3所示，為健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉紅外光譜的分層譜圖，xjk代表患枯萎病香蕉葉的紅外光譜圖，xj代表健康香蕉葉的紅外光譜圖。由圖可知，2種香蕉葉的紅外光譜圖波形相似，但在不同波長下的峰數、峰形與峰強度存在較為明顯的差異，其具體差異如下：在1032cm-1附近，患病香蕉葉形成一個較強的吸收峰，而健康香蕉葉形成的吸收峰明顯弱于患病香蕉葉；波長在1100～1500cm-1范圍內，2種香蕉葉在吸收峰的數量以及強度方面存在明顯的差異，健康香蕉葉在1416cm-1和1462cm-1處存在2個強度較弱的吸收峰，而患枯萎病香蕉葉則在1166cm-1、1317cm-1和1462cm-1處存在3個較弱的吸收峰；在1594cm-1以及1734cm-1附近，健康香蕉葉比患病香蕉葉的吸收峰更強；在2800～3000cm-1范圍內，健康香蕉葉于2916cm-1和2848cm-1處存在2個最強尖峰，而患枯萎病香蕉葉的吸收峰明顯變弱。綜上所述，健康香蕉葉的吸收峰明顯強于患枯萎病香蕉葉，故健康香蕉葉的物質成分如糖類、脂質、蛋白質以及碳水化合物等在含量上均高于患枯萎病香蕉葉。

圖2 4株患病香蕉葉的紅外光譜圖

圖3 健康香蕉葉與患病香蕉葉的紅外光譜圖

2.3 健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉的二階導數分析

二階導數紅外光譜可將一些微小的差異放大或將重疊峰展開[19]，故對健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉進行二階導數分析將有利于將2種不同的香蕉葉進行區(qū)分。如圖4所示，為健康香蕉葉與患病香蕉葉的二階導數圖。由圖4可知，2種香蕉葉在二階導數方面存在顯著差異，在1400～1800cm-1和2800～3000cm-1范圍內，健康香蕉葉的二階導數明顯強于患病香蕉葉。由于2800～3000cm-1附近主要是蛋白質與多糖的振動吸收峰，故健康香蕉葉的蛋白質與多糖含量更高，因此，利用二階導數紅外光譜法可以鑒別健康香蕉葉與患病香蕉葉。

圖4 健康香蕉葉與患病香蕉葉的二階導數圖

2.4 健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉的主成分分析

對健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉選擇900～1100cm-1、1100～1400cm-1、2800～3000cm-1范圍進行主成分1和主成分7分析，其結果如圖5所示，1為正常香蕉葉，2為患病香蕉葉，主成分1為橫坐標，貢獻率為99.28%，主成分7為縱坐標，貢獻率為0.29%，累計貢獻率為99.57%，說明以主成分1和主成分7為代表進行主成分分析是真實可靠的。由圖5可知，健康香蕉葉與患病香蕉葉分別聚合在2個不同的區(qū)域，并且兩者之間無交叉，說明利用主成分1和主成分7 2種成分能明顯地區(qū)分健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉。

圖5 4株健康香蕉葉與4株患枯萎病香蕉葉PCA分析

2.5 健康香蕉葉與患病香蕉葉的聚類分析

圖6為健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉在900～1100cm-1、1100～1400cm-1、2800～3000cm-1范圍內的二階導數聚類分析圖。由圖6可知，健康香蕉葉分為2類聚類，分別為xj1和xj4，xj3和xj2；患病香蕉葉分為3類聚類，分別為xjk2和xjk4，xj1與xjk2、xjk4聚為1類，xjk3與xj1、xjk2、xjk4聚為1類。4株健康香蕉葉和4株患病香蕉葉各聚為一大類，說明利用該聚類方法可有效區(qū)分健康香蕉葉與患枯萎病香蕉葉。

圖6 4株健康香蕉葉與4株患枯萎病香蕉葉的二階

3 討論

由傅里葉紅外光譜圖可知，2種不同的香蕉葉片在波形上極其相似，但在吸收峰的位置、強度以及大小方面存在顯著差異。在本研究中，4株健康香蕉葉的紅外光譜圖基本完全一致，4株患病香蕉葉中有一株香蕉枯萎病葉的圖譜與其他3株葉片的圖譜略有差異，可能是由其患病程度的不同而導致。此外，經過原始數據光譜分析以及二階導數圖譜分析，健康香蕉葉具有更強的吸收峰強度，從而表明健康香蕉葉的物質成分如蛋白質、脂質、多糖等在含量上均高于患病香蕉葉。將900～1100cm-1、1100～1400cm-1和2800～3000cm-13個具有顯著差異的波段進行PCA分析與聚類分析，可以清楚地區(qū)分出健康香蕉葉與患病香蕉葉。綜上所述，利用傅里葉紅外光譜分析技術，結合PCA分析以及聚類分析可以快速、準確、高效地區(qū)分出健康香蕉葉與患病香蕉葉，為準確、高效地鑒定香蕉枯萎病提供一種安全可靠的檢測方法，也為其它病蟲害的檢測提供一種新的研究思路。

4 結論

傅里葉光譜顯示健康香蕉葉的吸收峰明顯強于患病香蕉葉，因此健康香蕉葉的物質成分如糖類、脂質、蛋白質以及碳水化合物等在含量上均高于患病香蕉葉。

通過對900～1100cm-1、1100～1400cm-1和2800～3000cm-13個具有顯著差異二階導數的波段進行PCA分析與聚類分析，可以快速清楚地區(qū)分出健康香蕉葉與患枯萎病病香蕉葉。