含花青素雙層指示薄膜的貯藏穩(wěn)定性

王文艷 周 希 魏 貞 喻惜珍 熊國(guó)遠(yuǎn)

(1. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鄭州 451450；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 3. 安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

近年來，天然色素指示薄膜常用來檢測(cè)食品的新鮮度，其作用機(jī)制是食品在由新鮮到腐敗的過程中，微生物和蛋白氧化會(huì)釋放出胺類物質(zhì)，造成食品包裝內(nèi)的環(huán)境呈堿性，具有pH響應(yīng)性的天然色素會(huì)產(chǎn)生可見的顏色變化，以此判斷食品新鮮程度[1-2]。該方法具有低成本、實(shí)時(shí)、可生物降解和方便安全等優(yōu)點(diǎn)[3]。目前，具有pH響應(yīng)性的天然色素主要來源于植物提取物，例如花青素[4]、紅蘿卜提取物[5]、姜黃素[6]和馬黛茶提取物[7]等。但從植物中分離獲取的花青素極不穩(wěn)定，容易受溫度、pH、光、氧氣、酶和金屬離子的影響，從而發(fā)生降解。因此，如何提高天然色素在薄膜基質(zhì)中的穩(wěn)定性是亟待解決的問題。B?kowska等[8]發(fā)現(xiàn)，紫外線對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響要大于高溫和貯藏時(shí)間。Zhai等[9]采用含有TiO2的吉蘭糖膠基的光阻隔層(外層)來保護(hù)由瓊脂和花青素制成的指示層(內(nèi)層)。He等[10]將玉米醇溶蛋白薄膜和指示薄膜復(fù)合，制備出高疏水性和高機(jī)械性能的雙層指示膜。Zhou等[11]以卡拉膠基質(zhì)作為內(nèi)層，花青素、姜黃素和花青素—姜黃素(1∶1)為指示劑，魔芋葡甘聚糖和山茶油作為疏水保護(hù)外層，制備指示薄膜并測(cè)定各薄膜的理化性能，結(jié)果表明疏水保護(hù)層的嵌入顯著改善了指示薄膜的疏水性和抗紫外性能。上述研究均缺乏對(duì)指示薄膜貯藏穩(wěn)定性的研究。

研究擬以卡拉膠為基質(zhì)，花青素為指示層，魔芋葡甘聚糖和山茶油混合而成的乳化層作為疏水外層，通過澆鑄的方法制備雙層指示薄膜，測(cè)定指示薄膜在室溫、冷藏和冷凍條件下貯藏35 d的抗氧化性能、厚度、機(jī)械性能和水分等指標(biāo)，評(píng)價(jià)該指示薄膜的貯存穩(wěn)定性，以期為花青素指示薄膜的商業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

越橘花青素：純度35%，西安百川生物科技公司；

姜黃素：純度95%，北京索萊寶科技公司；

魔芋葡甘聚糖、κ-卡拉膠：合肥博美生物科技有限公司；

山茶油：江西寶林天然香料有限公司；

甘油：西隴科學(xué)股份有限公司；

吐溫80、聚苯乙烯培養(yǎng)皿和無水硅膠：上海源葉生物科技有限公司；

其余試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

分析電子天平：JA503型，常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；

超聲波細(xì)胞破碎儀：JY92-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速分散器：IKA型，德國(guó)IKA科技有限公司；

智能薄膜拉伸力學(xué)試驗(yàn)儀：XLW型，濟(jì)南蘭光光電技術(shù)有限公司；

全自動(dòng)手持色差計(jì)：CR-400型，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：PE-Lambda型，美國(guó)PE儀器有限公司。

1.3 花青素指示膜的制備與處理

參照文獻(xiàn)[11]的方法制備出花青素指示膜，將雙層指示膜放置在25 ℃環(huán)境中干燥72 h后待測(cè)。將干燥后的花青素指示膜分別置于25，4，-18 ℃下貯藏，每隔1周(0，7，14，21，28，35 d)取樣在室溫下平衡6 h后測(cè)定厚度、機(jī)械強(qiáng)度、色差和抗氧化性能等指標(biāo)。

1.4 理化指標(biāo)測(cè)量

1.4.1 機(jī)械性能 參考Ruan等[12]的方法并稍作修改。將花青素指示膜裁剪為8 cm×2 cm的矩形，使用薄膜拉伸儀測(cè)量斷裂伸長(zhǎng)率(EAB)，初始夾具之間的距離設(shè)置為60 mm，以50 mm/min的拉伸速度進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)量抗拉強(qiáng)度(TS)。

1.4.2 厚度 利用精度為0.001 mm的螺旋測(cè)微器進(jìn)行測(cè)定，在每片薄膜上隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。

1.4.4 抗氧化性能

(1) 總酚含量測(cè)定：稱取25 mg薄膜加入到3 mL乙醇溶液中混合均勻后得到提取液?？偡雍康臏y(cè)定參考Balqis等[13]的方法進(jìn)行。量取0.3 mL提取液，加入2.5 mL 福林酚試劑(體積分?jǐn)?shù)10%)，再加入2 mL 7.5 g/mL碳酸鈉溶液，50 ℃水浴5 min后于600 nm處測(cè)量吸光度值。用沒食子酸溶液(0～1 000 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以每克薄膜的微克沒食子酸當(dāng)量(GAE)表示。

(2) DPPH自由基清除率測(cè)定：參照Adilah等[14]的方法。量取3 mL提取液并加入1 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液后混合均勻并在黑暗處室溫靜置30 min。測(cè)量混合液和以未加提取液的DPPH溶液在517 nm處的吸光度值。DPPH自由基清除率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

S——DPPH自由基清除率，%；

A1——加入提取液的DPPH溶液的吸光度值；

A2——未加提取液的DPPH溶液的吸光度值。

(3) ABTS自由基清除率測(cè)定：參照文獻(xiàn)[14]并略作修改。將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液以體積比1∶1混合并靜置16 h。將所得混合液用乙醇稀釋直至其在734 nm處的吸光度值在0.70±0.02。同時(shí)，將40 mL薄膜乙醇提取液加入到3 960 mL稀釋液中后靜置6 min，測(cè)定其在734 nm處的吸光度值。用沒食子酸溶液(0～1 000 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以每克薄膜的微克沒食子酸當(dāng)量(GAE)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析，多重比較采用LSD法，使用Origin 2021進(jìn)行作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極其顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械性能

由圖1可知，在25，4，-18 ℃貯藏35 d后薄膜的斷裂伸長(zhǎng)率分別為(19.13±5.94)%，(19.56±3.64)%，(18.47±3.73)%，相較于0 d的分別下降55.28%，55.29%，57.81%(P<0.05)，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，所有薄膜在貯藏期間的斷裂伸長(zhǎng)率總體呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。貯藏第14天，25 ℃組的EAB顯著低于-18 ℃組(P<0.05)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是低溫下薄膜中山茶油的均勻度保持較好，山茶油起到的增塑作用并未減弱，與文獻(xiàn)[11]研究結(jié)果一致，適量山茶油的添加顯著改善了薄膜的EAB。由圖2可知，薄膜在25 ℃下貯藏7 d時(shí)的TS值顯著大于0 d的(P<0.05)，與EAB的變化趨勢(shì)相反，可能是以魔芋葡甘聚糖和卡拉膠為主要基質(zhì)的薄膜在貯藏過程中發(fā)生了氧化，導(dǎo)致薄膜老化，且在老化過程中，水分和增塑劑遷移到周圍環(huán)境，最終導(dǎo)致薄膜的TS值增大。此外，薄膜貯藏第7～35天TS無顯著變化(P>0.05)，但整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能是由于山茶油的增塑作用導(dǎo)致EAB增大，EAB的增大往往導(dǎo)致TS降低。薄膜的EAB在貯藏35 d后相較于0 d的顯著下降(P<0.05)，結(jié)合水、自由水的損失、甘油的滲出以及在不同環(huán)境溫度下薄膜的老化速度造成了EAB的下降。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時(shí)間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時(shí)間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時(shí)間的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.2 厚度穩(wěn)定性

由圖3可知，在貯藏第7～35天指示薄膜的厚度保持穩(wěn)定，薄膜的厚度范圍為0.126～0.162。薄膜在第7天的厚度相較于0 d的顯著增大(P<0.05)，其原因可能是山茶油作為疏水性材料添加到親水性KGM基質(zhì)中后在不同的溫度下貯藏時(shí)形成了不致密且較疏松的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致指示膜厚度的增加，與Liu等[15]研究結(jié)果一致。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時(shí)間的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.3 顏色穩(wěn)定性

由表1可知，指示薄膜在不同溫度下貯藏L*值呈先升高后下降的趨勢(shì)，且貯藏35 d后，指示薄膜在25，4，-18 ℃ 的L*值相較于貯藏0 d的分別下降2.4%，13.13%，26.80%，下降的原因可能與成膜基質(zhì)化學(xué)構(gòu)成有關(guān)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魔芋葡甘聚糖和卡拉膠分子結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化和重排[16]，重排過程中基質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，從而降低了薄膜的透明度，導(dǎo)致指示薄膜L*降低。-18 ℃下薄膜L*值下降的速率要高于25 ℃和4 ℃下的，可能是由于低溫下整體老化程度較低，且低溫下自由水可形成冰晶，導(dǎo)致指示薄膜的不透明度升高，造成L*下降。

由表2可知，25 ℃貯藏下的薄膜a*值總體比較穩(wěn)定，只有貯藏第35天出現(xiàn)顯著變化(P<0.05)，原因在于薄膜在貯藏過程中，水和甘油從薄膜基質(zhì)中發(fā)生遷移。指示薄膜在不同溫度下a*值的變化可能受花青素結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變和山茶油狀態(tài)的影響。

由表3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，25，4，-18 ℃貯藏指示薄膜的b*值均顯著增大(P<0.05)。色差的測(cè)定結(jié)果表明，指示薄膜在-18 ℃貯藏時(shí)a*和b*的變化小于25 ℃和4 ℃下的，因此薄膜在-18 ℃貯藏時(shí)具有良好的顏色穩(wěn)定性。

2.4 抗氧化性能的變化

2.4.1 總酚含量的變化 由圖4可知，貯藏7 d后薄膜的總酚含量顯著下降(P<0.05)。當(dāng)貯藏溫度不變時(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，薄膜的總酚含量呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)，且-18 ℃貯藏的薄膜總酚含量下降速率最大，可能是由于薄膜中的花青素和山茶油中的酚類物質(zhì)與薄膜基質(zhì)(KGM-CAR)結(jié)構(gòu)通過氫鍵相連，導(dǎo)致其在抗氧化分析中不能與自由基相互作用，從而降低了花青素在低溫下的抗氧化活性。薄膜在25 ℃貯藏第14天和第21天時(shí)總酚含量下降速率顯著快于4 ℃和8 ℃下的(P<0.05)，這是由于花青素的熱敏性，溫度越高，花青素結(jié)構(gòu)被破壞越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致其總酚含量的快速降低。

表1 指示薄膜在不同溫度和時(shí)間下L*值的變化?

表2 指示薄膜在不同溫度和時(shí)間a*值的變化?

表3 指示薄膜在不同溫度和時(shí)間下b*值的變化?

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時(shí)間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時(shí)間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.2 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度對(duì)指示薄膜的DPPH自由基清除能力的影響不顯著(P>0.05)，含有花青素的指示薄膜在不同溫度下貯藏中前期(0～28 d)保持了比較好的抗氧化活性。此外，-18 ℃貯藏35 d后指示薄膜的DPPH自由基清除能力最低，與Adilah等[14]發(fā)現(xiàn)的在大豆分離蛋白中添加芒果核提取物貯藏90 d后的結(jié)果一致。指示薄膜在貯藏7 d后對(duì)DPPH自由基清除能力逐漸升高，可能是由于山茶油中酚類物質(zhì)的釋放量增加引起的。這也從側(cè)面說明薄膜的抗氧化活性主要是由酚類物質(zhì)提供的。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時(shí)間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時(shí)間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.3 ABTS自由基清除能力 由圖6可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，薄膜在不同溫度下貯藏的ABTS自由基清除能力總體呈下降的趨勢(shì)。25 ℃條件下，貯藏第14天薄膜的ABTS自由基清除能力達(dá)到最高值，為9.44 μg/g，比4 ℃和-18 ℃下的最高值高出24.90%和21.08%。在成膜過程中，高溫使魔芋葡甘聚糖和卡拉膠結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，成膜基質(zhì)和其他化合物之間通過氫鍵鍵合，使成膜基質(zhì)不能完全恢復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)，從而改善了成膜基質(zhì)與花青素、水和甘油之間的相互作用，但在25 ℃貯藏時(shí)，薄膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使與薄膜結(jié)合的花青素和山茶油中的酚類物質(zhì)的釋放，從而使得薄膜在25 ℃貯藏14 d有最高的ABTS自由基清除能力。此外，不同溫度貯藏35 d后ABTS自由基清除能力相較于貯藏14 d的顯著下降與結(jié)合水、增塑劑和山茶油的損失有關(guān)。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時(shí)間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時(shí)間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

由于薄膜結(jié)構(gòu)中山茶油、水和甘油的損失，貯藏時(shí)間越長(zhǎng)薄膜的老化程度越高，薄膜結(jié)構(gòu)的變化或重排影響了薄膜的抗氧化性能。從抗氧化能力的結(jié)果來看，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，薄膜的總酚含量和ABTS自由基清除能力下降，但DPPH自由基清除能力升高。這可能是由于薄膜中所含的花青素和山茶油中會(huì)與水和甘油一樣從薄膜基質(zhì)中遷移到外界環(huán)境中。此外，抗氧化性能的降低不僅是由于花青素的損失，很大程度上也歸結(jié)于薄膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。

3 結(jié)論

薄膜的貯藏穩(wěn)定性隨著貯藏時(shí)間和溫度的變化而變化。薄膜在貯藏過程中機(jī)械性能、顏色和抗氧化性性能的變化與結(jié)合水和甘油導(dǎo)致薄膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)重排以及花青素和山茶油的損失有關(guān)。但研究?jī)H從宏觀層面分析了指示薄膜性能的變化，并未從機(jī)理上探討變化發(fā)生的原因，未來可利用掃描電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜等技術(shù)手段從微觀層面探討各種變化發(fā)生的原因和機(jī)理。