蕓豆體外模擬消化液的抗氧化和α-淀粉酶抑制活性及其淀粉水解動力學(xué)

石 娟 包鴻慧 張 佩 張倜培 周 睿

(湖北文理學(xué)院食品科技學(xué)院，湖北 襄陽 441053)

蕓豆又名四季豆和菜豆，全球種植面積僅次于大豆，尤其在亞洲國家被廣泛應(yīng)用于焙烤產(chǎn)品、豆餡、沙拉及罐頭等傳統(tǒng)食品中[1]。蕓豆富含膳食纖維、淀粉、蛋白質(zhì)、植物化學(xué)物質(zhì)及微量元素等多種營養(yǎng)組分[2]。與馬鈴薯淀粉和谷類淀粉相比，蕓豆淀粉(C-型)具有較高的直鏈淀粉含量、更加牢固的直鏈淀粉間交互作用及較低的淀粉消化率[3]。蕓豆蛋白無麩質(zhì)，富含賴氨酸且消化率高，是人類膳食蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)來源，具有降膽固醇、癌癥預(yù)防及2型糖尿病防治等多重健康益處[4]。此外，酚酸、類黃酮(兒茶素和原花青素等)和縮合單寧是蕓豆籽粒主要的酚類化合物，具有良好的抗氧化、降血糖、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤及抗衰老等功效[5]。

目前，有關(guān)蕓豆的研究主要集中在營養(yǎng)組分[5]，功能活性[1,6-7]，加工工藝對物化特性、活性組分及功能活性的影響[3,8-10]等方面。蕓豆各營養(yǎng)組分只有經(jīng)人體胃腸道消化吸收并參與新陳代謝，才能有效發(fā)揮其最大功效。體外模擬消化是通過體外構(gòu)建與體內(nèi)消化環(huán)境相近的消化模型，模仿口腔、胃和腸道階段對食物的消化分解歷程，已被廣泛應(yīng)用于食物中活性組分的生物可及性和生物可利用性評估[10-14]，但蕓豆體外胃腸模擬消化的研究僅局限于蕓豆α-淀粉酶抑制劑[10]、蕓豆蛋白[13]及蕓豆淀粉[14]的體外消化特性研究，而有關(guān)煮制蕓豆體外胃腸模擬消化液的生物活性及其淀粉消化動力學(xué)與葡萄糖擴散性能的研究尚未見報道。

研究擬選用3種花色蕓豆(白、紅和黑色)為原料，通過體外胃腸模擬消化模型，分析煮制蕓豆消化液總酚、總黃酮和酸性多糖含量、抗氧化活性與α-淀粉酶抑制活性，以及消化過程中淀粉水解動力學(xué)與葡萄糖擴散性能，并探究消化液活性組分含量與體外生物活性及淀粉水解特征參數(shù)的相關(guān)性，旨在合理認知與評價全蕓豆食品的生理功效，為不同花色蕓豆資源的功能性開發(fā)與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黑蕓豆：產(chǎn)地為黑龍江省哈爾濱市，長度為(9.82±0.79) mm，寬度(5.76±0.56) mm，單粒重(0.20±0.03) g(n=50)，市售；

紅蕓豆：產(chǎn)地為山西省大同市，長度為(16.12±1.33) mm，寬度(7.28±0.78) mm，單粒重(0.54±0.10) g(n=50)，市售；

白蕓豆：產(chǎn)地為湖北省恩施州利川市，長度為(25.24±2.08) mm，寬度(16.34±1.35) mm，單粒重(1.82±0.36) g(n=50)，市售；

α-淀粉酶(A3176)、胃蛋白酶(P7000)、膽汁鹽(48305)、胰酶(P7545)、α-葡萄糖苷酶(G5003)：美國Sigma-Aldrich公司；

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、4-硝基酚-α-D-呋喃葡萄糖苷(pNPG)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：上海阿拉丁有限公司；

L-抗壞血酸(VC)、蘆丁、沒食子酸、β-D-半乳糖醛酸：上海源葉生物科技有限公司；

D-葡萄糖測定試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；

其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機：BO-1000S1型，永康市鉑歐五金制品有限公司；

電子分析天平：FA1004N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

高速離心機：LC-LX-L6OD型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

恒溫振蕩水浴鍋：SHA-B型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：LDO-9070A型，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；

紫外可見分光光度計：L5S型，上海精密儀器儀表有限公司；

純水機：Milli-Q 型，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 精選籽粒飽滿、質(zhì)地均勻、無蟲蝕劣變的干凈蕓豆，粉碎，過60目篩，密封避光冷藏(-20 ℃)備用。其中，白蕓豆粉、紅蕓豆粉及黑蕓豆粉淀粉含量分別為(46.84±0.31)%，(49.44±0.55)%，(48.49±0.82)%；水分含量分別為(10.31±0.26)%，(9.35±0.21)%，(9.82±0.18)%；蛋白質(zhì)含量分別為(22.27±0.52)%，(24.00±0.37)%，(23.52±0.49)%；脂肪含量分別為(1.86±0.04)%，(1.61±0.06)%，(2.11±0.08)%；灰分含量分別為(4.01±0.07)%，(4.55±0.15)%，(4.16±0.11)%。

1.2.2 體外模擬消化 參照Minekus等[11]的方法并修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g豆粉，加入裝有5 mL蒸餾水的消化試管中。室溫磁力攪拌10 min，旋蓋封口，95 ℃水浴20 min，37 ℃恒溫水浴鍋冷卻得豆粉糊液。

(1) 體外模擬口腔消化階段(SSF)：向豆粉糊液中加入3.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 7.0)以及3粒玻璃珠，震蕩1 min，依次添加0.5 mLα-淀粉酶液(1 gα-淀粉酶懸浮于10 mL蒸餾水中，3 500 r/min離心10 min)和150 μL CaCl2溶液(50 mmol/L)，混勻，100 r/min、37 ℃水浴5 min。

(2) 模擬胃液消化階段(SGF)：向模擬口腔消化液中加入5 mL蒸餾水，并用1 mol/L HCl溶液迅速調(diào)節(jié)體系pH至3.0，添加1 mL胃蛋白酶液(1%)和30 μL CaCl2溶液，100 r/min、37 ℃水浴2 h。

(3) 模擬腸道消化階段(SIF)：用1 mol/L NaOH溶液迅速調(diào)節(jié)模擬胃消化體系pH至7.0，依次加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液、5 mL胰酶和膽汁鹽混合溶液(胰酶20 mg/mL，膽汁鹽50 mg/mL)和240 μL CaCl2溶液，100 r/min、37 ℃水浴2 h。消化結(jié)束后，將消化管于沸水浴中煮制5 min，冷卻至室溫。5 000 r/min離心10 min并收集上清液，用蒸餾水定容，用于活性組分含量、抗氧化及α-淀粉酶抑制活性測定。同時，將模擬消化液直接轉(zhuǎn)入透析袋中進行模擬葡萄糖吸收特性評價。

1.2.3 活性組分測定

(1) 總酚含量：福林酚比色法。

(2) 總黃酮含量：三氯化鋁比色法。

(3) 酸性多糖含量：硫酸咔唑比色法[15]。

1.2.4 抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除活性：參照Brand-Williams等[16]的方法。

(2) ABTS+自由基清除活性：參照Re等[17]的方法。

(3) 鐵離子還原抗氧化能力(FRAP)：參照Benzie等[18]的方法。

1.2.5α-淀粉酶抑制活性測定 參照Tan等[19]的方法并略作修改。采用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.9)配制小麥淀粉溶液(質(zhì)量分數(shù)為1%)，并煮沸15 min。α-淀粉酶溶液(1 U/mL)用含有6.7 mmol/L NaCl的磷酸緩沖液配制。加入20 mL 3,5-二硝基水楊酸(96 mmol/L)和8 mL 酒石酸鉀鈉(5.31 mol/L，2 mol/L NaOH配置)，混勻，加入12 mL去離子水稀釋制備DNS溶液。將500 μLα-淀粉酶與500 μL樣品混勻，37 ℃孵育10 min。加入500 μL淀粉溶液，孵育10 min，加入1 mL DNS試劑，沸水浴滅酶5 min，冷卻，加入10 mL去離子水，混勻，測定540 nm處吸光度，并按式(1)計算α-淀粉酶活性抑制率。

ω=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%，

(1)

式中：

ω——α-淀粉酶活性抑制率，%；

A1——非抑制組，即磷酸緩沖液、淀粉液、酶液及DNS試劑混合體系的吸光值；

A2——空白對照組，即磷酸緩沖液、淀粉液及 DNS試劑混合體系的吸光值；

A3——抑制組，即樣品、淀粉液、酶液及DNS試劑混合體系的吸光值；

A4——背景對照組，即樣品、淀粉液及DNS試劑混合體系的吸光值。

1.2.6 蕓豆淀粉消化性能測定 參照Zhang等[20]的方法并略作修改。從模擬口腔消化結(jié)束階段、模擬胃消化結(jié)束階段以及模擬腸消化階段(0，10，20，30，60，90，120 min)分別等量量取0.1 mL消化液轉(zhuǎn)移至裝有0.9 mL 95%乙醇的微量離心管中，旋蓋渦流震蕩混勻，終止酶反應(yīng)，12 000 r/min離心5 min取上清液，采用GOPOD試劑盒法測定消化液中釋放的葡萄糖含量。并分別按式(2)～式(5)計算淀粉水解率(HI)以及快速消化淀粉(RDS)、緩慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)含量。

HI=[(At-A)×0.9]/W×100%，

(2)

RDS=[(A20-A)×0.9]/W×100%，

(3)

SDS=[(A120-A20)×0.9]/W×100%，

(4)

RS=[1-(A120-A)×0.9/W]×100%，

(5)

式中：

At——體外模擬消化過程中t時刻釋放的葡萄糖量，mg；

A20、A120——模擬腸消化20，120 min后釋放的葡萄糖量，mg；

A——消化前混合體系所含的游離葡萄糖量，mg；

W——淀粉總質(zhì)量，mg。

C=C∞[1-exp(-Kt)]，

(6)

式中：

C——水解過程中t時刻的淀粉水解率，%；

C∞——淀粉水解的平衡濃度，%；

K——一級反應(yīng)動力學(xué)速率常數(shù)，min-1。

1.2.7 消化液葡萄糖擴散性能測定 參照Zhang等[20]的方法并略作修改。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入透析袋(分子量截留值3 500 Da)中，置于裝有450 mL磷酸緩沖液(pH 6.8)的燒杯中，37 ℃恒溫水浴，分別于0，10，20，30，60，90，120，150，180 min量取0.1 mL等份樣品，采用GOPOD試劑盒測定透析液中葡萄糖濃度。每次等量取出樣品后，再等量補充0.1 mL磷酸緩沖液于燒杯中，并按式(7)計算消化液葡萄糖擴散速率。

V=Gt/t，

(7)

式中：

V——葡萄糖擴散速率，μg/min；

Gt——透析過程中t時刻透析液中的葡萄糖量，μg；

t——透析時間，min。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有試驗平行測定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Excel 2019軟件進行基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計；采用SPSS 26.0軟件進行Duncan多重比較及相關(guān)性分析；采用ANOVA算法進行單因素方差分析；采用Origin 9.0軟件進行圖表繪制。顯著性水平選定P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓豆消化液的活性組分含量

由表1可知，3種蕓豆消化液總酚含量為14.80～17.47 mg GAE/g，高于王何柱等[22]的研究結(jié)果；總黃酮含量為3.63～6.32 mg RE/g以及酸性多糖含量為34.00～39.38 mg AGE/g，其中黑蕓豆消化液的總酚、總黃酮及酸性多糖含量最高，白蕓豆的最低。Kan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，26種蕓豆總黃酮含量為0.19～7.05 mg RE/g，與試驗測定值略有差異，且其對原料生豆粉中水溶性膳食纖維的半乳糖醛酸的測定值(0.15%～0.60%)遠低于試驗測定結(jié)果。此外，梁亞靜等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黑蕓豆總酚含量為7.3 mg GAE/g，總黃酮含量為2.4 mg RE/g，低于試驗煮制黑蕓豆消化液的測定值(17.47 mg GAE/g和6.32 mg RE/g)，這可歸因于體外胃腸模擬消化體系有利于蕓豆粉中酚類物質(zhì)及多糖等活性組分的釋放[25]。

2.2 蕓豆消化液的抗氧化活性

由表2可知，3種蕓豆消化液對DPPH自由基與ABTS+自由基清除能力及鐵離子還原抗氧化能力分別為6.74～8.75，45.74～49.75，4.39～19.82 mg AAE/g。黑蕓豆和紅蕓豆消化液的抗氧化能力明顯強于白蕓豆，且存在顯著性差異(P<0.05)，與王何柱等[22]的結(jié)論保持一致，可能是由不同花色蕓豆消化液中的多酚、黃酮類及酸性多糖等抗氧化活性物質(zhì)含量差異所致。

表1 蕓豆消化液總酚、總黃酮及酸性多糖的含量?

2.3 蕓豆消化液對α-淀粉酶的抑制活性

由表2可知，3種蕓豆消化液對α-淀粉酶具有一定的抑制能力，活性抑制率為20.99%～31.22%，黑蕓豆消化液抑制能力最強，紅蕓豆次之，白蕓豆最弱，且樣品間抑制率差異顯著(P<0.05)，可歸因于蕓豆籽粒中富含α-淀粉酶抑制劑[26]，但體外模擬胃消化環(huán)境易引起α-淀粉酶抑制劑活性組分的破壞損失，導(dǎo)致其α-淀粉酶抑制活性有所降低[10]。

表2 蕓豆消化液的抗氧化活性與α-淀粉酶抑制活性?

2.4 蕓豆淀粉體外消化動力學(xué)

由圖1可知，在0～5 min模擬口腔消化階段(SSF)與125～245 min模擬腸消化階段(SIF)，由于淀粉酶的存在，促使淀粉水解速率加快；而在5～125 min模擬胃消化階段(SGF)，由于淀粉酶的缺失與低pH環(huán)境，導(dǎo)致淀粉水解速率變緩。SSF消化階段，白蕓豆、紅蕓豆及黑蕓豆的淀粉消化水解率分別為5.75%，4.34%，3.79%；SIF消化結(jié)束時，3種蕓豆淀粉水解率分別提升至52.73%，49.11%，47.28%。模擬腸消化階段(SIF)前20 min內(nèi)，3種蕓豆淀粉消化速率快速增加，隨后淀粉消化曲線趨于平緩。與白蕓豆相比，紅蕓豆與黑蕓豆淀粉水解率在SIF階段20 min時分別下降了15.46%，19.37%，在SIF消化階段120 min時分別下降了6.87%，10.34%。

圖1 蕓豆淀粉體外模擬消化Figure 1 In vitro simulated digestion of kidney bean starch

由表3可知，3種蕓豆淀粉消化過程曲線擬合性較好(R2>0.96)，蕓豆淀粉的水解動力學(xué)速率常數(shù)K為0.061～0.081 min-1，其中紅蕓豆與黑蕓豆的K值較小，白蕓豆的較大，表明紅蕓豆與黑蕓豆淀粉的消化速率明顯低于白蕓豆。王苗苗等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蕓豆籽粒細胞淀粉消化速率K為0.000 1 min-1，消化程度為4.21%，遠低于試驗結(jié)果，主要是由于其采用豬胰酶體外酶解生蕓豆試驗體系與試驗選用的煮制蕓豆體外胃腸模擬消化模型存在顯著差異所致。白蕓豆中快速消化淀粉含量(RDS)較高為42.05%，緩慢消化淀粉含量(SDS，10.67%)與抗性淀粉(RS，47.28%)含量相對較低，而紅蕓豆與黑蕓豆RDS含量相對較低(35.55%和33.91%)，SDS與RS含量相對較高(13.55%和13.37%，50.90%和52.72%)。馬夢婷等[27]研究發(fā)現(xiàn)，10種蒸煮雜豆粉的RDS含量為61.2%～70.6%，明顯高于試驗結(jié)果，可能是由于原料品種來源及選用的體外淀粉消化方式不同所致。

表3 蕓豆淀粉體外模擬消化特征參數(shù)?

2.5 蕓豆消化液中葡萄糖擴散特性

由圖2可知，透析液中葡萄糖濃度呈先快速上升后增加變緩的趨勢，而葡萄糖擴散速率呈先快速降低后趨于平緩的趨勢。透析0～20 min，3種蕓豆消化液中葡萄糖擴散能力較強，但透析20～180 min，葡萄糖擴散速率明顯減慢。當(dāng)透析時間為10 min時，白蕓豆、紅蕓豆和黑蕓豆透析液中葡萄糖質(zhì)量濃度分別為78.60，71.07，68.54 mg/L，相應(yīng)的葡萄糖擴散速率分別為3 536.80，3 198.07，3 084.52 μg/min。透析結(jié)束時，3種蕓豆透析液中擴散葡萄糖最終質(zhì)量濃度分別提高至113.48，105.55，101.77 mg/L，但相應(yīng)的葡萄糖擴散速率(283.69，263.88，254.42 μg/min)卻快速降低了91%以上。與白蕓豆相比，透析180 min時，紅蕓豆與黑蕓豆透析液葡萄糖濃度分別下降了6.99%，10.32%，表明紅蕓豆與黑蕓豆消化液中的葡萄糖擴散能力明顯弱于白蕓豆。這可能與消化液體系中活性物質(zhì)的組成及含量差異性有關(guān)。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，具有增強體系黏稠特性的水溶性膳食纖維(多糖)有助于延緩消化釋放葡萄糖的擴散性與吸收性。

圖2 蕓豆消化液中葡萄糖的擴散能力Figure 2 Glucose diffusion ability of kidney bean digestive solution

2.6 相關(guān)性分析

由表4可知，蕓豆消化液活性組分總酚、總黃酮及酸性多糖含量與3種抗氧化活性均呈顯著正相關(guān)性(r>0.99，P<0.05)，表明蕓豆經(jīng)體外胃腸模擬消化后釋放的總酚、總黃酮及酸性多糖等活性組分對消化液表現(xiàn)出的抗氧化活性起到重要作用，與梁亞靜等[24]的結(jié)論一致。蕓豆消化液活性組分與葡萄糖擴散速率V180呈顯著負相關(guān)性(r>0.99，P<0.05)，表明蕓豆相關(guān)活性組分對消化液中的葡萄糖擴散起到了一定的抑制作用，可能歸因于：① 蕓豆模擬消化期間酚類物質(zhì)不斷釋放，一定程度上減弱了淀粉酶的消化降解，導(dǎo)致豆粉顆粒細胞破裂崩解程度變緩，消化殘渣顆粒的阻礙作用延遲了葡萄糖的擴散；② 消化體系釋放的水溶性多糖大分子有助于消化液黏稠度的增強，從而抑制葡萄糖的擴散[20,28]；③ 可溶性膳食纖維表面吸附的帶正電荷花色苷可通過與葡萄糖分子活性羥基相結(jié)合，促進葡萄糖的吸附及葡萄糖擴散的抑制[29]。蕓豆消化液活性組分與α-淀粉酶抑制率及淀粉水解速率常數(shù)(K)的相關(guān)性不顯著，但Pearson相關(guān)系數(shù)r高達0.88以上，可能是由于蕓豆消化體系中其他組分(可溶性蛋白、多肽等)及組分間的協(xié)同效應(yīng)(多酚—蛋白及多酚—多糖等)對α-淀粉酶抑制活性和淀粉消化吸收性產(chǎn)生了重要影響[9,30]。因此，顏色較深蕓豆品種有利于胃腸模擬消化體系的抗氧化活性和α-淀粉酶抑制活性的增強，以及淀粉消化速率與釋放葡萄糖擴散速率的減弱，具有潛在的健康促進功效。

表4 蕓豆消化液活性組分與體外抗氧化和α-淀粉酶抑制活性及淀粉消化特征參數(shù)的相關(guān)性?

3 結(jié)論

利用體外胃腸模擬消化模型研究了3種蕓豆消化液的總酚、總黃酮和酸性多糖含量、抗氧化活性及α-淀粉酶的抑制活性，并考察了淀粉體外酶解動力學(xué)與葡萄糖擴散性能。結(jié)果表明，3種蕓豆消化液均具有良好的抗氧化活性和一定的α-淀粉酶抑制活性。黑蕓豆消化液總酚、總黃酮和酸性多糖含量、α-淀粉酶抑制活性以及緩慢消化淀粉和抗性淀粉含量最高，而淀粉水解率、一級動力學(xué)淀粉水解速率、平衡濃度、快速消化淀粉含量以及消化液葡萄糖擴散量和擴散速率均最低。Pearson相關(guān)性分析表明，蕓豆消化液活性組分含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，與葡萄糖擴散速率呈顯著負相關(guān)。后續(xù)可進一步研究蕓豆體外和體內(nèi)消化過程中可溶性膳食纖維(多糖)—多酚、多酚—蛋白(多肽)等協(xié)同交互效應(yīng)對蕓豆消化活性物質(zhì)的釋放、生物利用率及其生物活性的影響機制。