二氧化鈦納米顆粒對玉米幼苗吸收鎘及其植物毒性的影響

鄭澤其，李劍濤，吳佳妮，連加攀，史瑞瀅，劉維濤

（南開大學環(huán)境科學與工程學院污染過程與基準教育部重點實驗室/天津市城市環(huán)境污染診斷與修復技術工程中心，天津 300350）

土壤是農業(yè)生產(chǎn)和人類生存的重要物質基礎，然而隨著工農業(yè)的快速發(fā)展，農田土壤中的重金屬污染日益嚴重[1]。重金屬鎘（Cd）具有溶解度高、移動性強、半衰期長等特點，被認為是毒性最大的重金屬之一[2]。2014 年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，Cd的點位超標率高達7.0%，位居所調查的污染物之首，嚴重污染程度點位的比例高達0.5%[3]。Cd能降低植物體內的光合色素，影響植物的細胞周期和分裂，甚至會導致植物染色體發(fā)生畸變[4]，并可通過食物鏈傳遞，對動物和人體的健康構成極大威脅[5]。因此，土壤Cd污染的修復和治理迫在眉睫。

納米顆粒（NPs）被定義為至少在一個維度上小于100 nm 的顆粒，其具有比表面積大和表面能高等特點[6]。其中，二氧化鈦納米顆粒（TiO2NPs）是應用最廣泛的NPs 之一，主要應用于食品添加劑、油漆、個人護理品、化妝品、太陽能電池、生物傳感器等生產(chǎn)過程中[7-8]。據(jù)報道，TiO2NPs 的年生產(chǎn)量可達88 000 t，全球釋放進入環(huán)境中的TiO2NPs超過納米材料總量的1/4[9]，其中13.8%的TiO2NPs進入土壤環(huán)境[10]。

目前，國內外眾多學者已開展了TiO2NPs與植物的交互作用研究[7]。TiO2NPs 對植物的生長具有正面或負面效應，這取決于植物品種、暴露濃度、暴露途徑和粒徑大小[11]。已有研究證實，隨著TiO2NPs 濃度的增加，煙草（Nicotiana tabacum）幼苗的生長和發(fā)育水平顯著降低[12]。TiO2NPs 也會對蘿卜（Raphanus sativus）根尖造成嚴重的DNA 損傷[13]。但亦有研究表明TiO2NPs 顯著提高菠菜（Spinacia oleracea）硝酸還原酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸-丙酮酸轉氨酶的活性，促進菠菜的氮代謝[14]。

近年來，利用NPs促進污染土壤植物修復的研究方興未艾[15]。NPs 可以直接去除污染物，促進植物生長，提高污染物的植物有效性，從而在植物修復系統(tǒng)中發(fā)揮作用[7-8]。TiO2NPs 根暴露可以降低Cd 在水稻（Oryza sativa）根和葉中的吸收、分布，降低Cd 對水稻的毒性[16]。本課題組前期的水培試驗研究[11]表明，TiO2NPs 葉暴露可有效地緩解Cd 對玉米（Zea mays）的毒性，降低Cd 在玉米中的積累；而TiO2NPs 根暴露則促進了玉米對Cd 的吸收。然而，水培環(huán)境與真實土壤環(huán)境相差甚遠，TiO2NPs 根暴露是否可以有效促進玉米修復土壤中的Cd 污染仍未可知。因此，在前期研究基礎上，為進一步探究根部施用TiO2NPs強化玉米修復Cd 污染土壤的可行性，本研究特開展了土壤盆栽試驗，通過對玉米生長指標、生理生化特性、玉米地上部和根系的Cd 含量、整株Cd 提取量以及Cd轉運系數(shù)等進行分析，探討不同濃度TiO2NPs在根部施用對玉米吸收和積累Cd及Cd毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗于2020年5—7月在南開大學津南校區(qū)環(huán)境科學與工程學院（38°59′15.49″N，117°19′53.08″E）開展。供試土樣采自南開大學津南校區(qū)西北門附近綠地，土壤類型為棕壤，待土樣自然風干后過2 mm篩以去除土壤中的雜質。土壤的基本理化性質：pH 值7.51，有機質含量1.453%，總氮、總磷和總鉀含量分別為1.355、1.180 g·kg-1和1.025 g·kg-1，有效磷含量120 mg·kg-1，有效鉀含量415.67 mg·kg-1，陽離子交換量（CEC）13.86 cmol·kg-1，Cd含量0.11 mg·kg-1。

TiO2NPs（純度：99.8%，5～10 nm，銳鈦）購自上海邁瑞爾化學技術有限公司，TiO2NPs 的平均粒徑為（6.5±0.76）nm，比表面積為264.8 m2·g-1。將添加于土樣中的TiO2NPs 超聲振蕩30 min，制備成TiO2NPs懸浮液，備用。供試作物為玉米（Zea maysL.cv ND488），購自天津市津南區(qū)種子公司。

1.2 試驗方法

選取大小均勻、顆粒飽滿的玉米種子浸泡于3%的H2O2溶液中消毒10 min。隨后將玉米種子用蒸餾水淋洗3次，以去除種子表面殘留的H2O2溶液。用蒸餾水將種子浸泡30 min，使種子膨脹軟化。最后，將種子播種于裝有1 kg 過篩風干土的塑料盆中。每隔3 d定時定量澆水。在幼苗出齊后，進行第一次間苗；待幼苗長至3～4 片真葉時，進行第二次間苗。最終，每盆保留5株幼苗（圖1）。

圖1 土培試驗Figure 1 Soil culture experiment

試驗共設12 個處理，用不同濃度的CdCl2·2.5H2O 和TiO2NPs 染毒（表1），將其以溶液形式拌入1 kg土壤后裝盆，平衡4周，每個處理3次重復。將玉米幼苗于溫室（溫度28 ℃，相對濕度50%～80%，光照強度2 300 lx）中培養(yǎng)一個月。其間，每日光照時間為8：00—19：00，共11 h。定期改變各個塑料盆的位置，從而排除環(huán)境差異引起的誤差。土培試驗處理組設計如表1所示。

表1 土培試驗中Cd和TiO2 NPs的濃度設置Table 1 Concentrations of Cd and TiO2 NPs in pot-culture experiment

1.3 測試方法

生長指標測定：培養(yǎng)結束時測定玉米的株高和根長；將玉米于103 ℃烘箱內烘干至恒質量后，分別用電子天平稱量各組幼苗的鮮質量和干質量。

葉綠素提取與測定：參照李得孝等[17]的方法，幼苗生長至2～3 葉期剪取葉片并剪成2 mm 碎條，一半裝入塑料袋放于冰箱中冷凍，另一半在室溫下稱取0.2 g植物鮮樣，用研磨法（80%丙酮與95%乙醇）和直接浸提法（6種提取液）提取葉綠素。每種方法設3個重復，每次重復取樣200 mg左右。樣品研磨后用濾紙過濾（洗滌定容25 mL），在645 nm和663 nm波長下測定吸光值。浸提法在黑暗中進行，并不時搖動，約14 h后定容測定吸光值，放置4 h后再測定一次吸光值。

抗氧化酶液提取與測定[18]：稱取0.1 g植物新鮮葉片，加4 mL 預冷的100 mmol·L-1PBS 緩沖液[pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA 和1%（m/V）PVP]，冰浴研磨。勻漿液于4 ℃、15 000g下離心15 min。所得上清液即為待測酶的粗提液。丙二醛（MDA）的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法，超氧化物歧化酶（SOD）的測定采用氮藍四唑（NBT）法，抗壞血酸過氧化物酶（APX）的測定采用抗壞血酸氧化反應法，過氧化物酶（POD）的測定采用愈創(chuàng)木酚法。

參照LIU 等[4-5]的方法，將干燥的植物樣品磨成粉末，過0.149 mm 孔徑篩。植物粉末（0.50 g）用含有87%濃縮HNO3和13%濃縮HCLO4（V/V）的12 mL 溶液在微波消解儀（SINEO MDS-6G）中消解。采用原子吸收分光光度計（AAS，Hitachi 180-80）測定消解液中Cd含量。

Cd提取量是衡量TiO2NPs強化植物修復Cd污染的重要指標[4]，計算公式如下：

式中：CCd為玉米中Cd 的含量，mg·kg-1（以干質量計）；mDW為每株玉米的干質量，g·株-1。

轉運系數(shù)（Translocation factor，TF）可用于評估植物將重金屬從根部轉移至地上部的能力[2]，是指植物地上部Cd 含量與地下部Cd 含量的比值，計算公式如下：

式中：Cshoot和Croot分別為玉米地上部和根部的Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均重復檢測3 次，采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 16.0 對測得數(shù)據(jù)進行計算、處理與統(tǒng)計分析，利用LSD（Least significant difference）對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，并用Origin 9.0制圖。

2 結果與分析

2.1 添加TiO2 NPs和Cd對玉米生長的影響

與對照（CK）相比，單一TiO2NPs或Cd處理，亦或二者聯(lián)合處理對玉米的株高（圖2A）和根長（圖2B）均無顯著影響（P＞0.05）。TiO2NPs 單一處理對玉米的鮮質量（圖2C）和干質量（圖2D）也無顯著影響（P＞0.05）。當TiO2NPs 處理濃度為200 mg·kg-1時，相比于對照組，玉米幼苗的鮮質量升高了22.61%（圖2C）。Cd 脅迫對玉米幼苗的生物量具有一定的抑制作用。Cd 單一暴露條件下，隨著Cd 濃度的升高，玉米幼苗的鮮質量降低，在Cd 最高濃度（50 mg·kg-1）時，鮮質量降低了20.35%（圖2C）。與鮮質量類似，玉米幼苗干質量隨著Cd 濃度的增加而降低，當Cd 暴露濃度為10 mg·kg-1和50 mg·kg-1時，玉米幼苗干質量分別顯著（P＜0.05）降低了29.14%和33.42%（圖2D）。

TiO2NPs 的施用在一定程度上降低了Cd 對玉米的植物毒性，主要表現(xiàn)在TiO2NPs 對Cd 脅迫引起的玉米幼苗生物量的降低具有緩解作用。當Cd脅迫濃度為10 mg·kg-1時，施用50 mg·kg-1和200 mg·kg-1的TiO2NPs 可使玉米幼苗干質量明顯增加27.40%和34.77%；當Cd 脅迫濃度為50 mg·kg-1，施用TiO2NPs濃度為50 mg·kg-1和200 mg·kg-1時，玉米幼苗的干質量分別增加了27.09%和35.34%（圖2D），表明施用TiO2NPs 對玉米幼苗的鮮質量和干質量具有一定的提升作用。

圖2 不同處理玉米的株高（A）、根長（B）、鮮質量（C）和干質量（D）Figure 2 Plant height（A），root length（B），fresh weight（C）and dry weight（D）of maize under different treatments

2.2 TiO2 NPs和Cd對玉米葉綠素含量的影響

Cd 脅迫對玉米幼苗的葉綠素造成破壞，降低了葉綠素的含量，影響植物進行光合作用。單一Cd 暴露情況下，隨著Cd 濃度的增加，葉綠素a（圖3A）和葉綠素b（圖3B）的含量均隨之降低。當Cd 的濃度為50 mg·kg-1時，相比于對照組，玉米幼苗的葉綠素a 和葉綠素b 含量分別顯著（P＜0.05）下 降36.64% 和32.72%。而單一TiO2NPs添加時，玉米幼苗的葉綠素含量均高于對照組。當TiO2NPs 的濃度為200 mg·kg-1時，相比于對照組，玉米幼苗的葉綠素a 含量顯著（P＜0.05）增加了18.40%，而葉綠素b 含量增加了9.46%。此外，在TiO2NPs 和Cd 聯(lián)合暴露情況下，Cd濃度為2 mg·kg-1時，外源添加200 mg·kg-1TiO2NPs使玉米幼苗的葉綠素a 和葉綠素b 含量分別增加7.88%和12.14%。在Cd 濃度為50 mg·kg-1時，外源添加200 mg·kg-1TiO2NPs可使玉米幼苗的葉綠素a和葉綠素b含量分別顯著（P＜0.05）增加42.48%和35.55%。由此可見，TiO2NPs 可促進玉米幼苗葉綠素的形成，提高其光合作用效率。

圖3 不同處理玉米葉綠素a（A）和葉綠素b（B）的含量Figure 3 Contents of chlorophyll a（A）and chlorophyll b（B）in maize under different treatments

2.3 TiO2 NPs 對Cd 脅迫下玉米氧化損傷和抗氧化酶活性的影響

Cd 可以通過干擾PSⅠ和PSⅡ途徑中的電子傳遞鏈、置換酶類物質的活性中心、破壞細胞內氧化還原平衡等，導致活性氧的產(chǎn)生[19]。過量的活性氧積累會引起細胞膜脂質過氧化，對植物造成過氧化損傷。MDA 是脂質過氧化過程的主要終產(chǎn)物之一，通常利用它作為脂質過氧化指標[20]。如圖4A 所示，Cd 脅迫下玉米幼苗的MDA 含量升高。當Cd 的濃度為50 mg·kg-1時，相比于對照組，玉米幼苗的MDA 含量顯著（P＜0.05）升高了112.72%。類似地，在單施TiO2NPs 處理中隨著TiO2NPs 濃度的升高，玉米幼苗的MDA 含量也逐漸上升，但變化不顯著。在共同添加Cd 和TiO2NPs 的處理組中，玉米幼苗的MDA 含量均隨著TiO2NPs 濃度的增加而下降。當Cd 濃度為50 mg·kg-1時，添加50 mg·kg-1和200 mg·kg-1TiO2NPs 的玉米幼苗MDA 含量分別下降了10.52%、24.15%。

圖4 不同處理玉米幼苗的MDA含量（A）以及SOD（B）、APX（C）、POD（D）活性Figure 4 MDA contents（A）and SOD（B），APX（C），POD（D）activities of maize seedlings under different treatments

與對照組相比，Cd 脅迫下三種抗氧化酶的活性均增強，10 mg·kg-1和50 mg·kg-1Cd 脅迫分別使玉米幼苗的SOD 活性顯著提高了62.25%、72.65%（圖4B）；10 mg·kg-1Cd 處理使APX 的活性提高了32.46%（圖4C）；50 mg·kg-1Cd 脅迫使POD 的活性提高了46.02%（圖4D）。TiO2NPs 的添加在一定程度上可以提高玉米SOD、APX、POD 的活性。在Cd 和TiO2NPs共同暴露下，隨著TiO2NPs 濃度的增加，SOD、APX、POD 的活性均逐漸增強，但TiO2NPs 對Cd 脅迫下玉米幼苗的SOD 和APX 活性的影響不顯著。當Cd 濃度分別為10 mg·kg-1和50 mg·kg-1時，200 mg·kg-1TiO2NPs處理導致玉米幼苗的POD活性分別顯著（P＜0.05）提高了47.91%和44.23%。

2.4 TiO2 NPs對玉米吸收和轉運Cd的影響

玉米幼苗對重金屬Cd 的吸收是一個復雜的過程，Cd 先通過植物根系組織的質膜橫向運輸，再由木質部運輸?shù)降厣喜縖21]。如圖5所示，隨著Cd濃度的增加，玉米幼苗的地上部、根部Cd 含量以及Cd 提取量均逐漸增加。當Cd的濃度為50 mg·kg-1時，玉米幼苗地上部、根部Cd 含量以及Cd 提取量分別為Cd 濃度2 mg·kg-1時的5.17、11.00、5.43 倍。當Cd 的濃度從2 mg·kg-1上升到50 mg·kg-1時，玉米幼苗的轉運系數(shù)顯著下降了40.84%（圖5C）。

當土壤中Cd 濃度為10 mg·kg-1時，外源施用TiO2NPs提升了玉米地上部（圖5A）和根部（圖5B）Cd含量。尤其是當土壤Cd 為10 mg·kg-1時，50 mg·kg-1TiO2NPs顯著（P＜0.05）提高了地上部Cd含量。TiO2NPs可促進Cd 在玉米幼苗中的轉運以及玉米對Cd 的提取。當Cd 處理濃度為10 mg·kg-1時，50 mg·kg-1TiO2NPs 處理顯著（P＜0.05）提高了Cd 的轉運系數(shù)（圖5C）和提取量（圖5D）。

圖5 不同處理玉米幼苗地上部（A）、根部（B）Cd含量以及Cd的轉運系數(shù)（C）和提取量（D）Figure 5 Cd content in shoots（A）and roots（B），translocation factor（C）and Cd extraction quantity（D）of maize seedlings under different treatments

3 討論

研究表明，植物受重金屬Cd 毒害的主要癥狀表現(xiàn)為植株矮小、發(fā)育遲緩、萎蔫枯黃[2，4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)與單一Cd 脅迫相比，加入TiO2NPs 在一定程度上減少了Cd對玉米的氧化損傷，提升了玉米干質量、鮮質量、葉綠素含量及抗氧化酶活性，表明TiO2NPs 的施用可緩解Cd 對玉米植株的毒害作用。SINGH 等[22]也發(fā)現(xiàn)，Cd（50、100、150 mg·kg-1）暴露降低了大豆（Glycine max）的干質量和鮮質量，而TiO2NPs 的施用提高了大豆的生物量，緩解了Cd對大豆的植物毒性。GONG 等[23]的研究也表明，500 mg·kg-1多層碳納米管（MWCNTs）處理促進了苧麻（Boehmeria nivea）幼苗生長，緩解了Cd的植物毒性。

TiO2NPs 的暴露途徑可對Cd 的植物毒性及其在植物中的吸收產(chǎn)生影響。本課題組前期的水培試驗表明，TiO2NPs 的葉面暴露可以有效地緩解Cd 對玉米的毒性，降低Cd在玉米中的積累，但根暴露卻促進了玉米對Cd 的吸收[11]。本研究進一步證實，在土培條件下，TiO2NPs 根暴露可促進玉米植株對Cd 吸收，并顯著提高了玉米幼苗的葉綠素含量。類似地，SINGH 等[22]研究證實TiO2NPs 通過提高植物的光合速率和生長參數(shù)來抑制Cd 毒性。RALIYA 等[24]和SERVIN 等[25]也發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 處理可以提高西紅柿（Solanum lycopersicum）和黃瓜（Cucumis sativus）的葉綠素含量。此外，JI 等[26]的研究表明TiO2NPs 提高了Cd脅迫下水稻的凈光合速率和葉綠素含量。

抗氧化酶體系是植物細胞本身具有的抵御氧化損傷的系統(tǒng)，植物受到重金屬脅迫時，抗氧化酶系統(tǒng)響應是其重要的耐性機制[19]。在逆境條件下，抗氧化酶的活性會增強，以清除細胞中積累的活性氧，維持組織中的氧化還原平衡[27]。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧陰離子自由基，通過歧化反應將O-2·轉化為H2O2和O2，產(chǎn)生的H2O2可進一步在過氧化物酶（POD）的催化下降解為完全無毒害的H2O[28]?？箟难徇^氧化物酶（APX）既是利用抗壞血酸（AsA）作為電子供體的H2O2清除酶，又是維生素C代謝的主要酶類。本研究中SOD、APX、POD 三種抗氧化酶的活性變化趨勢基本一致，其與MDA 的含量變化相一致。這可能是由于TiO2NPs 通過改善抗氧化酶的活性來抑制玉米幼苗內活性氧的積累，使得MDA 的含量下降，減輕Cd 對玉米幼苗的毒害作用。TiO2NPs 能在一定程度上緩解Cd 脅迫對玉米幼苗造成的氧化損傷。這與JI 等[26]對水稻幼苗中MDA 含量變化的研究結果一致。類似地研究也發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 能提高油菜（Brassica napus）[29]、西紅柿（Lycopersicon esculentum）[30]和菠菜（Spinacia oleracea）[31]的光合作用參數(shù)和抗氧化系統(tǒng)活性。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著Cd 脅迫濃度逐漸提高，玉米幼苗的地上部、根部Cd 含量以及Cd 提取量均逐漸增加。SHAH 等[32]也發(fā)現(xiàn)水稻幼苗的地上部與根部Cd含量隨著Cd 濃度的增加而增加。整體而言，轉運系數(shù)隨著Cd 濃度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，這與本課題組之前的研究結果[2，5，33]一致。外源施用TiO2NPs 影響植物吸收Cd 的可能機理是：TiO2NPs 能提高葉綠體類囊體膜上Mg2+-ATPase 的活性[34]，根系釋放質子的通道則隨著質膜H+-ATPase 的激活而被激活，植物根系開始分泌質子并在根際形成酸性條件，從而增加了土壤Cd的植物有效性[35]。此外，TiO2NPs易形成團聚體并吸附土壤中的重金屬，從而降低了土壤中重金屬的植物有效性，可能也是TiO2NPs抑制植物吸收重金屬和緩解重金屬植物毒性的機理之一[36]。本研究還發(fā)現(xiàn)，盡管高Cd（50 mg·kg-1）處理下，TiO2NPs的外源施用降低了地上部和根部的Cd 含量，但玉米幼苗的Cd 提取量卻有所增加（圖5D），可能是由于TiO2NPs 的施用提高了玉米幼苗的生物量（圖2C 和圖2D）。

4 結論

（1）Cd對玉米的植物毒性體現(xiàn)在其抑制玉米幼苗的生物量、降低葉片的葉綠素含量、誘導脂質過氧化損傷。

（2）TiO2NPs 的施用可緩解Cd 對玉米的植物毒性，其可能的機理是TiO2NPs激活了玉米的抗氧化酶體系，提升了葉片的葉綠素含量，進而提高了玉米的生物量。

（3）當土壤Cd 濃度為10 mg·kg-1時，外源添加TiO2NPs 可顯著提高玉米地上部Cd 含量、轉運系數(shù)以及Cd 提取量，表明TiO2NPs 可用于強化植物修復土壤Cd污染。