微流控肺器官芯片的研究進(jìn)展

譚劍峰，周成斌

呼吸系統(tǒng)疾病是導(dǎo)致全球殘疾和死亡的主要原因[1]，其中慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是全球第三大死亡原因，有2億中度至重度的COPD患者[2]。哮喘被認(rèn)為是常見的慢性疾病，占全世界兒童總數(shù)的14%；肺炎也是5歲以下兒童死亡的主要原因；肺癌（包括氣管和支氣管癌）是最致命的癌癥，每年導(dǎo)致160萬人死亡[3]。為了解決這些問題，呼吸系統(tǒng)疾病在診斷和治療方面迫切需要新的進(jìn)展，微流控肺器官芯片模型（簡(jiǎn)稱肺器官芯片）通過微流控通道來模擬氣管或肺泡和血管，通過控制空氣或流體的流速來模擬肺泡中氣流的流速或血管中流體剪應(yīng)力，精準(zhǔn)模擬肺生理和病理?xiàng)l件，在人體肺生理、疾病病原學(xué)、毒理學(xué)研究和藥物篩選等方面顯示出了巨大潛力。

1 肺器官芯片的原理與制造

1.1 肺器官芯片的原理

肺器官芯片的主要原理是采用微加工的方法在聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚碳酸酯（polycarbonate，PC）、聚苯乙烯（polystyrene，PS）或羊皮紙及各種生物材料制成的微型芯片上加工出特定形狀的微結(jié)構(gòu)，通常芯片上有上下兩個(gè)微流控通道結(jié)構(gòu)，上通道種植肺泡上皮細(xì)胞和提供氧氣，形成氣-液界面，模擬肺泡；下通道種植血管內(nèi)皮細(xì)胞和連續(xù)灌注培養(yǎng)液，模擬毛細(xì)血管通道和流體剪切應(yīng)力，中間由多孔薄膜將其分隔，模擬肺泡間隔；肺器官芯片的兩側(cè)存在側(cè)室與兩個(gè)真空泵相連，通過規(guī)律地改變側(cè)室的壓力，引起多孔薄膜規(guī)律的拉伸，模擬肺的呼吸運(yùn)動(dòng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后細(xì)胞會(huì)形成具有功能的組織單元，該芯片便稱為肺器官芯片[4～7]。見圖1[5]。

1.2 肺器官芯片的制造材料

肺器官芯片的材料是其加工制造和應(yīng)用的基礎(chǔ)，常用材料有PDMS、紙、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等。其中應(yīng)用最多的是PDMS，其組成成分包括預(yù)聚體和固化劑，先將兩者按照一定比例進(jìn)行混合，然后在常溫或加熱的條件下固化形成具有一定彈性的固體[8]。2010年哈佛大學(xué)Huh D等[5]首次制造肺器官芯片就是利用PDMS作為材料，之后研究者相繼利用PDMS為材料制造了肺水腫微芯片[9]、肺癌微芯片[10]和肺血栓微芯片[11]等。PDMS的主要優(yōu)點(diǎn)是無毒，透光性好，具有化學(xué)惰性，易于加工且成本低廉，因此被廣泛應(yīng)用于肺器官芯片的制造。但是PDMS材料的主要缺點(diǎn)是疏水，需要在其表面修飾一層生物兼容性較好的ECM或水凝膠材料，以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)[12，13]。另一缺陷是對(duì)疏水性藥物有較高的吸收率，不能利用PDMS的肺器官芯片進(jìn)行藥物篩選[14]。Rahimi R等[4]使用由激光直接處理的羊皮紙作為一個(gè)有效的半透膜用于氣-液界面細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建了培養(yǎng)單層肺上皮細(xì)胞的理想、穩(wěn)健且便宜的氣-液界面。但是疏水的羊皮紙也存在缺點(diǎn)，其一是需要激光處理才能形成親水性區(qū)域；其二長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致干濕抗張強(qiáng)度減弱，甚至有可能破壞半透膜。Li W[15]和Yang X等[16]利用PLGA納米纖維膜制造肺器官芯片，PLGA納米纖維膜具有良好的生物相容性和多孔性，利用納米靜電紡絲技術(shù)可以制備非常薄的膜（3μm左右）。然而PLGA材料強(qiáng)度不足，不能模擬流體剪應(yīng)力和拉伸應(yīng)力等生物物理因素。Zamprogno P等[17]利用膠原蛋白和彈性蛋白制成的生物、可拉伸和可降解膜的肺器官芯片，模擬了具有活體尺寸的微小肺泡陣列；這種膜在許多方面優(yōu)于PDMS，不吸收疏水性藥物，可生物降解，可以制備4μm左右的薄膜，是一種值得進(jìn)一步研究的肺器官芯片材料。

1.3 肺器官芯片的制造技術(shù)

目前最經(jīng)典的肺器官芯片制造技術(shù)是光刻技術(shù)，主要采用掩模板、光刻膠和紫外光等進(jìn)行肺器官芯片微結(jié)構(gòu)的成形。Huh D等[5]首先使用基于軟光刻的微制造技術(shù)設(shè)計(jì)了PDMS肺器官芯片模型。Sellgren KL等[18]也利用光刻技術(shù)設(shè)計(jì)了另一種包含上皮細(xì)胞氣道的微流控肺模型，這些細(xì)胞分別在氣-液界面、肺成纖維細(xì)胞層和微血管內(nèi)皮細(xì)胞層上培養(yǎng)，分別置于3個(gè)垂直堆疊的隔間中，每個(gè)隔間由納米孔膜隔開。Stucki AO等[19]采用光刻技術(shù)創(chuàng)建了一個(gè)可逆性結(jié)合的肺泡-芯片模型來模擬肺實(shí)質(zhì)的微環(huán)境，為了模擬體內(nèi)的隔膜，他們使用了一個(gè)微隔膜來拉伸肺泡屏障。光刻技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是工藝成熟，加工精度高，對(duì)于部分材料可達(dá)亞微米甚至納米級(jí)。其缺陷是對(duì)加工材料種類有限制，通常是硅、玻璃材料及PDMS；另外光刻設(shè)備的費(fèi)用比較昂貴，制造成本較高，一般醫(yī)療科研單位難以采用，多需聯(lián)系外單位進(jìn)行加工。

制造肺器官芯片的另一方法是模塑法，其原理是先利用光刻技術(shù)制備陽模，然后將液態(tài)的高分子材料傾倒至陽模表面，在重力、機(jī)械壓力及電場(chǎng)力等驅(qū)動(dòng)下，液態(tài)高分子材料填充至陽模的微結(jié)構(gòu)中，最后將液體材料固化并脫模即得所需的肺器官芯片微結(jié)構(gòu)[20～24]。Humayun M等[25]使用微研磨和溶劑黏合方法開發(fā)了肺器官芯片的熱塑性模型，該芯片再現(xiàn)了肺氣道微環(huán)境及平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和支持ECM之間的相互作用。模塑法制造肺器官芯片往往需要與光刻技術(shù)相結(jié)合，由于模塑法中的陽模可重復(fù)使用，所以該方法的制造費(fèi)用成本較低，可以用于批量化生產(chǎn)。

三維（three-dimensional，3D）打印技術(shù)也可以用于制造肺器官芯片。Park JY等[26]使用包含血管網(wǎng)絡(luò)的3D細(xì)胞生物打印技術(shù)組裝了一個(gè)氣道芯片模型，使用聚己內(nèi)酯、肺成纖維細(xì)胞生物墨水、內(nèi)皮細(xì)胞生物墨水和PDMS開發(fā)了一個(gè)微芯片平臺(tái)。Nawroth JC等[27]以PDMS為原料利用3D打印技術(shù)制造了人類氣道肺器官芯片模型，首次展示了活的人類鼻病毒（human rhinovirus，HRV）感染哮喘上皮細(xì)胞，再現(xiàn)了病毒誘發(fā)哮喘加重的復(fù)雜特征。3D打印設(shè)備昂貴，制造成本高，對(duì)技術(shù)人員要求高，而且3D打印技術(shù)只能針對(duì)部分材料進(jìn)行微納米級(jí)打印，暫不適合批量化生產(chǎn)。

2 肺器官芯片在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

2.1 肺器官芯片用于肺部炎癥研究

肺部炎癥是指由細(xì)菌、真菌、納米顆粒、免疫損傷、過敏原及藥物等所致的終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥。Huh D等[5]在肺器官芯片平臺(tái)上利用腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激上皮細(xì)胞可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)，激活的內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)人中性粒細(xì)胞在血管微通道中黏附并穿透肺泡-毛細(xì)血管屏障；利用大腸桿菌刺激肺泡上皮細(xì)胞也會(huì)引起中性粒細(xì)胞在血管微通道中募集，中性粒細(xì)胞穿過肺泡-毛細(xì)血管屏障后到達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞層，吞噬大腸桿菌；利用二氧化硅（SiO2）納米顆粒也會(huì)引起類似的炎癥反應(yīng)。此外，生理機(jī)械應(yīng)變和SiO2納米顆粒在上調(diào)ICAM-1表達(dá)和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生有協(xié)同作用，呼吸運(yùn)動(dòng)的機(jī)械應(yīng)變能顯著增強(qiáng)由SiO2納米材料導(dǎo)致的肺部炎癥發(fā)生，這種效應(yīng)與小鼠模型是一致的。

Zhang M等[28]構(gòu)建了一種新穎的3D人體肺器官芯片模型來重建人體肺的器官水平結(jié)構(gòu)和功能，納米顆粒誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的毒性機(jī)制包括氧化應(yīng)激、線粒體損傷、DNA損傷和炎癥反應(yīng)，隨著炎癥反應(yīng)的加重，肺泡-毛細(xì)血管的屏障功能減弱，部分納米顆?？梢源┻^肺泡-毛細(xì)血管屏障并轉(zhuǎn)移到其他器官。由此可見，肺器官芯片模型能夠重現(xiàn)人體內(nèi)病原微生物、炎性因子和納米顆粒等引起的肺部炎癥發(fā)生及免疫應(yīng)答過程，為肺部炎癥的研究提供了一個(gè)低成本的替代方案。

2.2 肺器官芯片用于支氣管哮喘研究

支氣管哮喘（bronchial asthma）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥，與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，常為廣泛而多變的可逆性呼氣氣流受限。Benam KH等[29]開發(fā)了一種肺小氣道芯片，微芯片支持分化的、黏液纖毛的細(xì)支氣管上皮和底層的肺微血管內(nèi)皮，而免疫細(xì)胞在底層流體中循環(huán)，被用于建模和研究哮喘和COPD的復(fù)雜過程，同時(shí)對(duì)治療反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。用白細(xì)胞介素13（interleukin-13，IL-13）處理微芯片小氣道時(shí)，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增加和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和分泌增加，纖毛跳動(dòng)頻率降低，這些都與哮喘患者氣道黏膜表現(xiàn)類似[30～32]。

Nawroth JC等[27]利用3D打印技術(shù)制造類人類氣道肺器官芯片模型，通過血管灌注IL-13來誘導(dǎo)Th2哮喘特征，并通過HRV-16感染上皮導(dǎo)致哮喘加重。首次利用肺器官芯片展示了活的HRV感染哮喘上皮細(xì)胞，動(dòng)態(tài)微環(huán)境可以實(shí)時(shí)研究健康和哮喘條件下的病毒感染、上皮細(xì)胞反應(yīng)和免疫細(xì)胞募集，再現(xiàn)了在哮喘患者和鼻病毒感染者中觀察到的關(guān)鍵特點(diǎn)。

2.3 肺器官芯片用于肺癌研究

在全球范圍內(nèi)，肺癌是致死率最高的實(shí)體癌之一[33]，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌類型的85%[34]。盡管NSCLC經(jīng)過多重方法的綜合治療，但是目前療效欠佳，晚期NSCLC 5年生存率約15%[35，36]，嚴(yán)重威脅人類健康。Hassell BA等[10]建立了人類NSCLC的肺器官芯片模型，以研究不同微環(huán)境下的癌癥行為、生長(zhǎng)和侵襲變化。研究表明，NSCLC腫瘤細(xì)胞在人類肺泡芯片中增殖速度比在氣道芯片中快得多，這些研究結(jié)果與肺腺癌患者體內(nèi)的研究結(jié)果相似[37]。同時(shí)，該研究還證明了呼吸模式的循環(huán)機(jī)械應(yīng)變的存在顯著地抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，利用這個(gè)肺器官芯片模型來研究腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)，結(jié)果表明呼吸運(yùn)動(dòng)抑制了NSCLC細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)。

Yang X等[16]以PLGA靜電紡絲納米纖維膜為芯片襯底和細(xì)胞支架，制造了肺器官芯片。該芯片實(shí)現(xiàn)了3D培養(yǎng)，人NSCLC細(xì)胞系（A549）、人肺成纖維細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞多種細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)利用該模型來評(píng)估一種表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向抗腫瘤藥物（吉非替尼）的療效。研究結(jié)果表明，人肺成纖維細(xì)胞1（human lung fibroblasts 1，HFL1）分泌的胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor-1，IGF-1）通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路抑制EGFR相關(guān)通路，維持腫瘤細(xì)胞，這可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物敏感性降低的一個(gè)原因。此外，他們發(fā)現(xiàn)A549可以通過引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或死亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲。

3 藥物研發(fā)與篩選

肺器官芯片在發(fā)現(xiàn)疾病的新機(jī)制、開發(fā)和篩選更安全、更有效地治療呼吸系統(tǒng)疾病的藥物方面有很大的潛力。例如Huh D等[9]進(jìn)行肺水腫的機(jī)制研究，測(cè)試了一種藥物，血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）來防止白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）誘導(dǎo)的血管滲漏。結(jié)果表明，當(dāng)Ang-1與IL-2共施時(shí)，可以穩(wěn)定內(nèi)皮連接，完全阻止IL-2產(chǎn)生的血管滲漏；盡管仍存在有節(jié)律性的機(jī)械張力，它進(jìn)一步防止了細(xì)胞旁間隙的形成。機(jī)械應(yīng)變可激活香草酸受體4（transient receptor potential vanilloid，TRPV4）離子通道[38]。因此機(jī)械應(yīng)變?cè)黾臃闻?毛細(xì)血管界面的通透性，導(dǎo)致肺內(nèi)血管滲漏[39]。由GlaxoSmithKline公司合成的一種新開發(fā)的TRPV4通道阻斷劑GSK2193874通過微血管通道注射，在循環(huán)機(jī)械應(yīng)變存在的情況下，它抑制IL-2誘導(dǎo)的血管通透性。這些發(fā)現(xiàn)為肺水腫患者提供了可行的治療方案。

當(dāng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的Janus活化激酶（Janus activated kinase，JAK）抑制劑Tofacitinib在哮喘微芯片模型上測(cè)試時(shí)[40]，它逆轉(zhuǎn)了IL-3誘導(dǎo)的哮喘變化。其Tofacitinib作用機(jī)制是抑制杯狀細(xì)胞增生，粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子分泌減少，纖毛跳動(dòng)頻率恢復(fù)正常。而在IL-13暴露芯片中發(fā)現(xiàn)地塞米松治療無效，這進(jìn)一步支持了地塞米松吸入治療不能緩解中重度哮喘患者癥狀的臨床發(fā)現(xiàn)[41]。這些結(jié)果也有助于JAK抑制劑在過敏性氣道疾病中的潛在應(yīng)用[42]。

Xu Z等[43]開發(fā)一種基于肺器官芯片的3D共培養(yǎng)模型，用于檢測(cè)肺癌藥物敏感性，以實(shí)現(xiàn)肺癌個(gè)體化治療。該裝置培養(yǎng)了細(xì)胞系和/或原代細(xì)胞，并檢測(cè)了它們對(duì)各種抗癌藥物的敏感性；準(zhǔn)確篩選與劑量相關(guān)的單藥和聯(lián)合抗腫瘤方案，以說明個(gè)體化治療的范圍。

4 問題與展望

盡管肺器官芯片得到一定程度的發(fā)展，但是同樣面臨如下挑戰(zhàn)。第一、肺器官芯片制造最常用的材料是PDMS，存在吸收疏水性藥物問題，限制了這種材料在制造用于藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)應(yīng)用的器官芯片方面的用途，急需尋找更優(yōu)的制造材料。第二、目前肺器官芯片的屏障膜厚度在10μm左右，而實(shí)際肺泡間隔厚度小于1μm，需要利用新材料和新方法制造超薄膜。第三、肺器官芯片中細(xì)胞種類太少，只包含整個(gè)器官細(xì)胞類型的一個(gè)子集，無法精準(zhǔn)模擬肺部的微環(huán)境。第四、微米級(jí)的肺器官芯片，種植細(xì)胞較少，再加上持續(xù)灌注培養(yǎng)，存在稀釋細(xì)胞產(chǎn)物的問題，檢測(cè)和分析細(xì)胞產(chǎn)物面臨挑戰(zhàn)。第五、對(duì)于肺泡呼吸過程中的空氣壓力和流量的變化，目前仍無法精準(zhǔn)模擬。第六、肺器官芯片需要PDMS層之間不可逆的永久結(jié)合，這使得獲取、分離和處理用于某些類型分析（如組織學(xué)和電子顯微鏡）的微型設(shè)備中產(chǎn)生的完整人體組織在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。第七、獲得具有增殖能力和完全分化能力的肺特異性細(xì)胞是另一挑戰(zhàn)。

肺器官芯片的出現(xiàn)依賴于微制造技術(shù)和細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，作為一種新的方法，具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力，旨在闡明復(fù)雜的病理生理學(xué)的肺疾病，并加快藥物開發(fā)和藥物篩選。隨著肺部疾病和藥物的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的增加，肺器官芯片有望成為一個(gè)蓬勃發(fā)展的平臺(tái)，為個(gè)人識(shí)別新的和可能的最佳治療方法，除了能改善患者的健康狀況，也能減少了制藥公司和研究人員對(duì)傳統(tǒng)體外細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的依賴。相信隨著科研人員的努力和新的制造技術(shù)發(fā)展，肺器官芯片將日趨完善，推動(dòng)肺部疾病個(gè)性化治療和藥物的開發(fā)和篩選。