基于下呼吸道標(biāo)本靶向宏基因組測(cè)序技術(shù)評(píng)估西藏高原地區(qū)社區(qū)獲得性肺炎的病原學(xué)分布特征

小巴桑 張艷艷 史丹丹 白瑪央金 史興亞 張?jiān)铺?賀航詠,2*

（1.拉薩市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，西藏 拉薩 850000；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100020）

社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumo‐nia，CAP)是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率和高病死率的常見(jiàn)疾病。CAP 占住院患者5%～15%，25%可發(fā)展為重癥CAP 需入住ICU，死亡率可以高達(dá)30～50%［1］。如何早期明確CAP 的病原學(xué)，對(duì)于早期選擇和啟動(dòng)針對(duì)性抗生素治療，縮短患者住院時(shí)間和改善預(yù)后至關(guān)重要。然而，目前臨床主要依賴于患者下呼吸道標(biāo)本的常規(guī)微生物檢測(cè)技術(shù)，如微生物的培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和特定病原學(xué)的核酸PCR 檢測(cè)，常常需要較長(zhǎng)等待時(shí)間，且敏感度和特異度低，并容易遺漏某些常見(jiàn)病原體。因此，尋找新的、更快速、且敏感和準(zhǔn)確的病原學(xué)檢測(cè)手段成為CAP 診治的核心環(huán)節(jié)。

二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）以高輸出量和高解析度為主要特色，可一次對(duì)數(shù)百萬(wàn)甚至數(shù)千萬(wàn)個(gè)DNA 序列進(jìn)行測(cè)序，對(duì)DNA 分子進(jìn)行序列讀取，獲得豐富的遺傳學(xué)信息的同時(shí)，還可大大降低測(cè)序費(fèi)用、縮短測(cè)序時(shí)間，可一次檢測(cè)大量靶基因。NGS 涵蓋耐藥基因檢測(cè)，因此可以檢出病原體的同時(shí)提示可能存在的耐藥性，指導(dǎo)臨床合理選擇敏感抗生素。靶向NGS（tNGS）技術(shù)針對(duì)呼吸道感染常見(jiàn)病原體進(jìn)行檢測(cè)，降低成本同時(shí)保持較好的病原學(xué)檢測(cè)敏感性，是針對(duì)CAP診治極有前景的一種快速病原學(xué)檢測(cè)方式［2］。

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)西藏高原地區(qū)CAP 患者中應(yīng)用tNGS 評(píng)價(jià)感染病原學(xué)分布特點(diǎn)的相關(guān)研究。因此，本研究擬通過(guò)前瞻性隊(duì)列研究評(píng)價(jià)基于tNGS 技術(shù)分析西藏高原地區(qū)CAP 患者下呼吸道病原學(xué)的分布特點(diǎn)，為臨床經(jīng)驗(yàn)性選擇抗生素提供數(shù)據(jù)支撐，以期進(jìn)一步精準(zhǔn)指導(dǎo)西藏高原地區(qū)CAP 抗生素的合理應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2021 年11 月至2022 年5 月于拉薩市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科因CAP 住院的患者。1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～90歲，男女均可；②符合中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診治指南中CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③患者具有明確的基因檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本如合格深部痰或肺泡灌洗液（BALF）；④受試者自愿加入本研究，簽署知情同意書，配合隨訪。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能留取合格下呼吸道標(biāo)本；②已明確下呼吸道感染病原體。

1.2 方法

入院后前三天內(nèi)采集所有納入患者的下呼吸道標(biāo)本，首選BALF 標(biāo)本，如患者無(wú)法耐受氣管鏡檢查，可考慮留取合格痰液標(biāo)本及誘導(dǎo)痰送檢。所有下呼吸道標(biāo)本均同時(shí)送檢常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)，包括常規(guī)細(xì)菌和真菌涂片、抗酸染色、培養(yǎng)（細(xì)菌、真菌）及非典型病原體和病毒血清學(xué)抗體。所有下呼吸道標(biāo)本同時(shí)送檢tNGS。

1.3 主要觀察指標(biāo)

①不同病原體陽(yáng)性檢出率及其分布特點(diǎn)；②不同標(biāo)本痰和BAFL液的陽(yáng)性檢出率的差異。③不同慢性氣道疾病與其他非慢性氣道疾病患者的病原學(xué)的分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)數(shù)資料以百分率表示（%），BALF 與痰tNGS 檢測(cè)陽(yáng)性率相比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。不同基礎(chǔ)疾病三組間采用方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

研究期間共測(cè)定下呼吸道tNGS樣本總數(shù)200例，其中BALF 標(biāo)本161 例，男性83 例（占51.55%），年齡55.80±17.96 歲；痰標(biāo)本39 例，其中男性15 例（占38.46%），年齡49.92±17.79 歲。依據(jù)患者是否存在COPD、支氣管擴(kuò)張或非慢性氣道疾病分組，COPD 患者29 例，支氣管擴(kuò)張患者14 例，其他非慢性氣道疾病患者157例。

2.2 西藏高原地區(qū)tNGS 檢測(cè)下呼吸道細(xì)菌、真菌和非典型病原體的病原學(xué)分布特點(diǎn)

如表1 所示，球菌中檢出率最高的為肺炎鏈球菌11.5%（21/200），其次為糞腸球菌7 例（3.5%）；桿菌中檢出率最高的為嗜血桿菌屬細(xì)菌58例（29%），其中流感嗜血桿菌34 例（17%），溶血嗜血桿菌24 例（12%）；其次為大腸埃希菌9 例（4.5%）。真菌中檢出最多為白色念珠菌46 例（23%），且在BALF 標(biāo)本中的檢出率顯著低于痰標(biāo)本（15.53% v.s.53.85%，p＜0.001）；其他病原體中最常見(jiàn)為結(jié)核分支桿菌24例（12%）；其次為肺炎支原體4 例（2%），且在BALF 中的檢出率顯著高于痰標(biāo)本檢出率（2.48%比0.00%，p＜0.05）。

表1 200例tNGS檢測(cè)下呼吸道細(xì)菌、真菌和非典型病原體的病原學(xué)分布特點(diǎn)

2.3 西藏高原地區(qū)tNGS檢測(cè)下呼吸道病毒的病原學(xué)分布特點(diǎn)

如表2所示，在常見(jiàn)呼吸道病毒中，鼻病毒檢出率最高，共30 例（15%），其中以A 型鼻病毒為主（16 例，8%）。其次為副流感病毒、冠狀病毒和細(xì)小病毒B19，各9 例（4.5%），其中細(xì)小病毒B19 在BALF 標(biāo)本中陽(yáng)性檢出率顯著高于深部痰標(biāo)本。偏肺病毒、腺病毒C型及呼吸道合胞病毒也較常檢出。在皰疹病毒科中，檢出率最高的為EB 病毒73 例（36.5%），其次為人類皰疹病毒7 型45 例（22.5%）和巨細(xì)胞病毒34 例（17%）。其中EB 病毒和人類皰疹病毒7 型均在痰液標(biāo)本中檢出率更高。

表2 200例tNGS檢測(cè)下呼吸道病毒的病原學(xué)分布特點(diǎn)

2.4 不同基礎(chǔ)疾病tNGS 檢測(cè)下呼吸道病原學(xué)分布特點(diǎn)

如表3 和表4 所示，結(jié)核分枝桿菌檢出率在COPD 組最高，顯著高于支氣管擴(kuò)張組和其他非慢性氣道疾病組（55.17%、0.00%、4.46%，p＜0.001）；銅綠假單胞菌在三組患者檢出率無(wú)顯著性差異。巨細(xì)胞病毒在COPD 患者中檢出率顯著低于其他兩組。

表3 200例不同疾病tNGS檢測(cè)下呼吸道細(xì)菌、真菌和非典型病原體的病原學(xué)分布特點(diǎn)

表4 不同基礎(chǔ)疾病患者tNGS檢測(cè)下呼吸道病毒的病原學(xué)分布特點(diǎn)

3 討論

本研究為首個(gè)基于tNGS 評(píng)價(jià)西藏高原地區(qū)CAP患者下呼吸道標(biāo)本病原學(xué)分布特點(diǎn)的前瞻性隊(duì)列研究。本研究提示西藏高原地區(qū)CAP 患者的主要病原學(xué)中，細(xì)菌以肺炎鏈球菌和嗜血桿菌屬為主，這與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道相一致。但在引起CAP 的常見(jiàn)病毒分布方面，國(guó)內(nèi)報(bào)道以流感病毒、副流感病毒和鼻病毒為主［3,4］，而我們的研究則提示，在西藏高原地區(qū)，流感和副流感病毒在CAP 中檢出率較低，同時(shí)鼻病毒檢出率最高，與國(guó)外的報(bào)道相似［5］。這一結(jié)果提示在西藏高原地區(qū)鼻病毒可能需要作為CAP 首要病毒類病原學(xué)作為考慮和啟動(dòng)早期針對(duì)治療。

非典型病原體如支原體在國(guó)內(nèi)其他地區(qū)也被報(bào)道為CAP的主要病原體之一，在部分中心CAP患者中非典型病原體檢出率可高達(dá)18.7%［6］。但在本研究中，肺炎支原體僅占2%，也提示高原地區(qū)肺炎支原體可能并非主要CAP 病原體。本研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌檢出率高達(dá)12%，提示西藏高原地區(qū)影像學(xué)提示CAP 時(shí)，尤其需要注意與肺結(jié)核的鑒別，積極行結(jié)核相關(guān)病原學(xué)檢查協(xié)助早期確立診斷和啟動(dòng)治療。

本研究也比較了不同標(biāo)本類型下不同病原體的檢出率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BALF 中肺炎支原體檢出率明顯高于痰標(biāo)本。肺炎支原體肺炎本身分泌物稀少，病原體在痰液標(biāo)本中可能濃度較低，導(dǎo)致其檢出率低；而BALF 可采集來(lái)自肺泡的標(biāo)本，從而提高檢出率［7］。因此在懷疑支原體肺炎且痰量較低或不咳痰的患者，應(yīng)積極考慮行氣管鏡留取BALF標(biāo)本以提高病原學(xué)的陽(yáng)性檢出率。白色念珠菌通常被視為上呼吸道的正常定植菌。本研究提示白色念珠菌在患者的下呼吸道標(biāo)本中檢出率高，且BALF 標(biāo)本中的檢出率顯著低于痰標(biāo)本。這提示西藏高原地區(qū)患者上呼吸道中白念定植率高，易在痰中檢出，需謹(jǐn)慎對(duì)待痰標(biāo)本tNGS檢出白色念珠菌的結(jié)果。

多項(xiàng)研究提示銅綠假單胞菌為慢性氣道疾病如COPD 和支氣管擴(kuò)張患者的常見(jiàn)定植和感染病原體［8-11］。本研究對(duì)這兩類慢性氣道疾病患者的tNGS結(jié)果與非慢性氣道疾病患者進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌檢出率在三組之間無(wú)差異。提示高原地區(qū)銅綠假單胞菌可能并非導(dǎo)致COPD和支氣管擴(kuò)張合并下呼吸道感染時(shí)的首要病原體。同時(shí)我們的研究也提示，COPD患者中結(jié)核分枝桿菌的檢出率明顯高于其他兩組。這一結(jié)果則提示，在高原地區(qū)COPD 急性加重入院患者中，需重視對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的篩查。

西藏高原地區(qū)的病毒感染檢測(cè)能力較弱。本研究通過(guò)tNGS 可以早期檢出多種病毒，包括常見(jiàn)的呼吸道RNA 病毒。本研究提示西藏地區(qū)CAP 的病毒病原體中，流感、副流感、普通冠狀病毒、細(xì)小病毒B19、偏肺病毒、腺病毒C 型及呼吸道合胞病毒也為常見(jiàn)病毒病原體。皰疹病毒科病毒雖檢出率高，但多數(shù)未給予治療患者病情好轉(zhuǎn)，因此考慮定植可能性大［12］。

綜上所述，西藏高原地區(qū)CAP感染病原體檢出類型多樣，且有自身地域特點(diǎn)，其中以肺炎鏈球菌、嗜血桿菌屬、白色念珠菌和鼻病毒在各類型病原體中檢出率最高。結(jié)核分枝桿菌檢出率在COPD組最高。需注意依據(jù)西藏高原地區(qū)不同病原學(xué)的分布特點(diǎn)，指導(dǎo)早期經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗生素。同時(shí)在CAP的臨床診療過(guò)程中，tNGS具有較高的敏感性和良好的RNA病毒檢出率，有助于早期明確病原學(xué)診斷和指導(dǎo)抗生素的精準(zhǔn)用藥。