基于生物信息學探討藏藥紅景天治療胃腺癌的有效成分及低氧相關mRNA研究*

楊帥 李根 陳港金 張亮亮 王月 汪紅兵,**

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院消化科；2.北京中醫(yī)藥大學研究生院，北京 100010；3.拉薩市人民醫(yī)院，西藏 拉薩 850000）

胃癌在全球有超過100 萬例病例，超過768，000人死亡，在癌癥類型中發(fā)病率排名第五，死亡率排名第三[1，2]，是最常見和最致命的胃腸道惡性腫瘤之一。胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)是胃癌最常見的組織學類型，占所有胃惡性腫瘤的95%以上，晚期STAD 患者的5 年生存率通常＜5%[3]。由于早期STAD 沒有典型癥狀，大多數(shù)患者在臨床上被診斷為晚期，通常預后不良。目前手術和化療治療是有效的治療方式，系統(tǒng)性治療可以緩解局部晚期或轉移性疾病患者的癥狀，提高生存率，改善生活質(zhì)量[4]。

腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境之間的持續(xù)相互作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和對治療的反應中起決定性作用[5]。由于腫瘤細胞生長速度過快，由氧消耗增加和氧供應不足之間的不平衡，腫瘤微環(huán)境常處于缺氧狀態(tài)，雖然腫瘤細胞可通過刺激新脈管系統(tǒng)的生長等方式適應缺氧微環(huán)境，但同時也導致更具侵襲性和治療抗性的腫瘤表型。缺氧誘導基因表達的變化和隨后的蛋白質(zhì)組變化，對各種細胞和生理功能產(chǎn)生許多重要影響，最終限制患者預后[6]。因此，改善腫瘤缺氧微環(huán)境改變對腫瘤的治療具有指導意義。藏藥紅景天是我國民族習用藥材，其性平味澀，具有補氣清肺、益智養(yǎng)心、收澀止血、散瘀消腫等功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載景天具有“祛邪惡氣，補諸不足”之功，李時珍在《本草綱目》中記載紅景天為“本經(jīng)上品，祛邪惡氣，補諸不足，為補益之佳品”。在治療高原缺氧類疾病，諸如急性、慢性缺氧性高原病具有良好的治療效果，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多個系統(tǒng)具有廣泛的藥理活性。現(xiàn)多項研究證明紅景天不僅具有抗缺氧、抗損傷、抗疲勞、抗抑郁、增強免疫力、促進心肌恢復的作用，而且具有明顯的抗惡性腫瘤作用，主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞轉移、調(diào)節(jié)腫瘤細胞信號傳導、增強機體免疫功能、減少機體炎癥反應及提高化療完成率等方面[7，8]。因此，研究紅景天通過作用于低氧相關mRNA治療STAD具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 STAD 差異相關基因及WGCNA 基因共表達模塊的獲得

從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲得轉錄組數(shù)據(jù)TCGA-STAD 數(shù)據(jù)[9]，從GEO 數(shù)據(jù)庫獲得轉錄組數(shù)據(jù)和臨床GEOSTAD 數(shù)據(jù)[10]。通過R 語言limma 包，設置篩選標準為| log2FC | ＞2、P.Val ＜0.01、FDR ＜0.05，對基因表達量進行規(guī)范，篩選出具有差異表達值的基因，通過R 4.2.1 語言的WGCNA 包，構建STAD 加權基因共表達網(wǎng)絡[11]。使用函數(shù)Pick Soft Threshold 選擇軟閾值β以建立無標度網(wǎng)絡，以基因間皮爾遜相關系數(shù)構建鄰接矩陣，轉換為拓撲重疊矩陣(TOM)及其相關的相似度(1-tom)，構建1-tom 矩陣的層次聚類樹將表達高度相關性的基因劃分為一個基因模塊，分別用不同的顏色表示。通過分析基因模塊和臨床特征之間的相關熱圖，將其與數(shù)據(jù)的臨床特征進行整合分析，評估每個模塊與正常組、腫瘤組臨床特征之間的相關性，并篩選正常組、腫瘤組中差異最大的基因模塊，獲取TC?GA 數(shù)據(jù)庫WGCNA 篩選獲得的基因(WGCNA-TC?GA)，GEO 數(shù)據(jù)庫WGCNA 篩選獲得的基因(WGCNAGEO)。

1.2 低氧相關基因的獲得

將關鍵詞“Hypoxia”輸入Genecards 數(shù)據(jù)庫，將Relevance score ＞1 作為篩選標準，檢索獲得低氧相關基因(hypoxia-target)。

1.3 紅景天活性成分篩選及有效作用靶點的獲得

通過檢索ETCM 和HERB數(shù)據(jù)庫收集紅景天的化學成分，從文獻中檢索有效成分作為補充，去除重復值，將有效成分輸入Swiss Target 和STITCH 數(shù)據(jù)庫獲取藥物的作用靶點。

1.4 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡構建與分析

TCGA數(shù)據(jù)庫WGCNA 篩選獲得的基因(WGCNATCGA)、GEO 數(shù)據(jù)庫WGCNA 篩選獲得的基因(WGC?NA-GEO)、低氧相關靶點(hypoxia-target)與紅景天有效成分作用靶點(Rhodiola rosea-target)之后，通過R 語言中“venn”“randomcolor”R 包，取四者交集靶點獲取韋恩圖，獲取紅景天作用在低氧相關mRNA 靶點上治療STAD 的作用靶點(Hub-target)。通過Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡，使用network analyzer 功能進行網(wǎng)絡特征分析，根據(jù)Degree、BetweennessCentrality 預測治療節(jié)點。

1.5 生物功能富集分析

將交集靶點導入利用R 語言“org.Hs.eg.db”“clus?terProfiler”“enrichplot”“ggplot2”“ggnewscale”等相關R包相關功能進行GO分析、KEGG分析。

1.6 紅景天治療胃腺癌核心靶基因的篩選與驗證

通過GEPIA2 數(shù)據(jù)庫分析Hub-target 在正常組與腫瘤組有無表達差異[12]，人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫分析Hub-target 在正常組與腫瘤組中的蛋白差異表達情況[13]，GEPIA2 數(shù)據(jù)庫進一步驗證篩選核心基因中STAD 患者總生存期之間的關系，以P＜0.05為差異具有計學意義，將其定義為核心基因。

2 研究結果

2.1 胃腺癌差異相關基因及WGCNA 基因共表達模塊

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得32 個正常樣本和375 個STAD 樣本；從GEO 數(shù)據(jù)庫GSE13861 中獲得19 個正常樣本和65 個STAD 樣本；通過R 篩語言limma 包篩選差異表達的基因，設置| log2FC | ＞2、P.Val ＜0.01為閾值篩選TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集、GEO-STAD 數(shù)據(jù)集的差異表達基因，通過R 語言的WGCNA 包構建加權基因共表達網(wǎng)絡。對樣本進行聚類，去除離群值后繪制樣本聚類樹。在TCGA-STAD 中選擇β=26(R2=0.9)構建無標度網(wǎng)絡，共獲得中的8個共表達模塊(圖1C)，我們選取藍色模塊(MEblue)、灰色模塊(MEgrey)作為差異基因相關的模塊，其中包含12502 個差異相關的基因，見圖1A、圖1B、圖1C。在GEO-STAD 中選擇β=3 (R2=0.9)構建無標度網(wǎng)絡，共獲得中的12 個共表達模塊(圖1 F)，我們選取綠黃色模塊(MEgreenyellow)、紫紅色模塊(MEmagenta)、橙紅色模塊(MEsalmon)作為差異基因相關的模塊，其中包含619個差異相關的基因，見圖1D、圖1E、圖1F。

2.2 低氧相關基因

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選獲得低氧相關基因1665個。

2.3 紅景天活性成分篩選及有效作用靶點

通過檢索ETCM 和HERB 數(shù)據(jù)庫及文獻補充，經(jīng)去重，共收集到紅景天活性化學成分38 個，見表1；

表1 紅景天有效成分

將有效成分輸入Drugbank 數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，共獲得387個活性作用靶點。

2.4 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡構建與分析

運用R 語言相關R 包，獲得交集基因，如圖2 所示，共獲得8 個紅景天作用在低氧相關mRNA 靶點上治療STAD“Hub-target”取交集獲得ESR2、FABP3、PT?GER2、ADA、CA9、CSNK2A1、HPSE、CCNB1 共8 個共表達核心基因。運用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡，見圖3。通過分析節(jié)點相連邊的數(shù)量，即度值（Degree）。獲得前5 位的Degree 排名化合物成分為：紅景天苷(Degree=10)、正辛醇(Degree=10)、沒食子酸乙酯(Degree=8)、山奈酚(Degree=8)、槲皮素(Degree=8)，見表2。通過分析介數(shù)中心性(Between?ness Centrality)。獲得前5 位的BetweennessCentrality排名化合物成分為：紅景天苷(Betweenness Centrality=0.0308)、正辛醇(Betweenness Centrality=0.0240)、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(Betweenness Centrality=0.0308)、桃金娘醇(Betweenness Centrality=0.0308)、辛酸(Betweenness Centrality=0.0308)，見表3。綜合度值及介數(shù)中心性分析，紅景天苷可能是紅景天作用在低氧相關基因上治療胃腺癌的核心有效成分。

表2 化合物Degree值

表3 化合物Betweenness Centrality 值

2.5 生物功能富集分析

為進一步闡明紅景天的作用機制，采用R 語言相關R 包對交集靶點通過GO 功能富集分析，得取生物過程（Biological Process，BP）279 個，細胞組成（Cell Composition，CC）17 個，分子功能（Molecular Function，MF）27 個。按P 值排序（P＜0.05）將前21 條繪圖表示，其中條目越長表示富集基因數(shù)越多，顏色越紅表示藥物對疾病的干預越密切，主要涉及染色體分離的調(diào)控、碳水化合物衍生物的分解代謝等生物過程；細胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔、Sin3 復合物、外著絲粒等細胞成分；前列腺素受體活性、腺苷脫氨酶活性等分子過程，見圖4A。對關鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，得到3 條信號通路，按P 值排序(P＜0.05)，發(fā)現(xiàn)主要涉及氮代謝、糖胺聚糖降解、原發(fā)性免疫缺陷通路，見圖4B。

2.6 紅景天治療胃腺癌核心靶基因的篩選與驗證

GEPIA2 數(shù)據(jù)庫評估Hub-target 在正常組與腫瘤組有無表達差異，發(fā)現(xiàn)ESR2、PTGER2、CSNK2A1、HPSE、CCNB1 在腫瘤組中高表達，F(xiàn)ABP3、ADA、CA9在腫瘤組中低表達，見圖5。通過HPA 數(shù)據(jù)庫驗證可獲得ESR2、FABP3、ADA、CA9、CSNK2A1、CCNB1 在正常組織樣本與腫瘤組織樣本中的蛋白表達信息，見圖6，經(jīng)驗證，可發(fā)現(xiàn)FABP3、ADA、CA9、CSNK2A1、CCNB1在正常組和腫瘤組中蛋白表達與GEPIA2正常組和腫瘤組的蛋白表達一致。通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫對Hub-target進行生存分析并通過單變量生存分析圖進行展示，其中，藍色曲線代表基因低表達患者，紅色曲線代表基因高表達患者，以P 值代表該基因在高、低表達患者中是否存在顯著性差異(P＜0.05)。通過Ka?plan-Meier 單變量生存分析顯示僅FABP3 的高表達與較差的總生存期(Overall Survival，OS)相關，見圖7。綜合上述結果，我們發(fā)現(xiàn)FABP3 在STAD 組織中表達下調(diào)，且FABP3 在腫瘤組中的高表達與STAD 患者總生存期較短相關。

3 討論

胃癌是臨床常見的癌癥之一，腺癌是胃癌的主要類型，分為兩種組織學亞型：高分化腸型和低分化彌漫型［14］。由于現(xiàn)代飲食方式改變、生活壓力增大、細菌感染等因素，使胃癌發(fā)病呈現(xiàn)年輕化傾向。胃癌發(fā)生從炎癥-萎縮-癌變的逐步進展是由多基因、多步驟、多階段組成的復雜過程，因素多且復雜［15］。早期癥狀隱匿不易發(fā)現(xiàn)，且治療手段有限，手術和化療是目前主要的治療手段，但是副作用較大，嚴重影響胃癌患者的生活質(zhì)量，預后通常欠佳［4］。祖國傳統(tǒng)民族習藥紅景天可輔助抗腫瘤治療［16］，可以有效改善體內(nèi)缺氧環(huán)境，有研究表明，可通過多重效用機制抑制腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展［17］。因此，需要尋找更好的紅景天治療STAD的有效化學成分及低氧相關作用靶點對特異性預后具有指導意義。

研究結果顯示，紅景天中共有38 個候選化合物，經(jīng)過生物信息學分析，其中治療STAD 最主要的活性是紅景天苷。紅景天苷是紅景天中提取的一種天然活性成分，屬于酚類次生代謝物，屬于紅景天中具有代表性的有效成分。不僅具有抗缺氧、抗衰老、神經(jīng)保護活性、抗纖維化活性、增強免疫功能、保護機體免受輻射損傷等功能，還具有抗腫瘤等作用。對胃癌、乳腺癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝癌等表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性［8,16］；可以抑制增殖和侵襲、誘導腫瘤自噬及凋亡，通過調(diào)控血管生成、克服耐藥、化療增敏、抗炎、增強免疫力來發(fā)揮抗腫瘤活性，改善腫瘤微環(huán)境［18-20］。

紅景天在治療STAD 中具有8 個與低氧作用靶點的基因，通過生存分析及HPA 數(shù)據(jù)庫驗證，發(fā)現(xiàn)其中最主要的核心基因為FABP3。FABP3，是脂肪酸結合蛋白(FABPs)家族的一員。FABPs 是一種豐富的細胞內(nèi)蛋白，可協(xié)調(diào)細胞內(nèi)脂質(zhì)的分布［21］、調(diào)節(jié)各種代謝、影響腫瘤的生長或增殖、參與炎癥途徑［22-24］。FABP3在心臟和骨骼肌中表達最高，在胃、腦、肺和乳腺中也有高表達，參與多種細胞功能。在間充質(zhì)細胞研究中，發(fā)現(xiàn)FABP3 在缺氧條件下上調(diào)，抑制細胞生長和增殖，增強細胞在缺氧或缺血環(huán)境下的存活率［25］。FABP3 可由HIF-1 誘導，并導致缺氧時顯著的脂滴積聚。在缺氧-復氧中，抑制脂滴形成增加了ROS 的毒性，降低了體外細胞存活率，抑制體內(nèi)的腫瘤發(fā)生［26］。生物學研究表明FABPs 在胃癌中的作用，表明FABP1/3/4/7 可能是用于胃癌診斷、治療的潛在靶標，F(xiàn)ABP3/4/8 可預示胃癌患者的預后［27］。靶向阻斷PD-L1 可降低胃腺癌細胞中FABP4/5 的表達，增加組織常駐記憶T 細胞(Trm 細胞)中FABP4/5 的表達，促進Trm 細胞的脂質(zhì)攝取，抑制Trm 細胞凋亡，改善胃腺癌預后［28］。這說明FABP3 可能是紅景天治療胃腺癌的低氧相關靶點之一，仍待進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究通過ETCM 和HERB 數(shù)據(jù)庫檢索、文獻補充篩選出紅景天的活性成分及作用靶點，通過Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選低氧相關mRNA 靶點，結合WGCNA 方法，篩選出8個紅景天治療STAD 低氧相關基因，這些核心基因的主要涉及染色體分離的調(diào)控、碳水化合物衍生物的分解代謝等生物過程，主要作用氮代謝、糖胺聚糖降解、原發(fā)性免疫缺陷通路。進一步分析發(fā)現(xiàn)，紅景天治療STAD 的主要的活性成分為紅景天苷，核心靶基因為FABP3，為STAD的診療提供新的思路。