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    獼猴桃潰瘍病檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展概述

    2022-12-01 20:52:34王燕平易春燕張翠翠陳慶東涂美艷
    四川農(nóng)業(yè)科技 2022年3期
    關(guān)鍵詞:潰瘍病獼猴桃病菌

    王燕平,易春燕,張翠翠,陳慶東,涂美艷

    (1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610066; 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610066)

    獼猴桃是一種雌雄異株的多年生大型落葉藤本漿果,具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值,富含豐富的VC,被稱為“果中之王”。近年來(lái),各地區(qū)獼猴桃患病的報(bào)道越來(lái)越多,尤其是獼猴桃潰瘍病。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是世界范圍內(nèi)的重大植物病害之一,主要是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(PSA)引起[1],該病菌是中國(guó)、美國(guó)、新西蘭和歐洲植物保護(hù)組織(EPPO)的植物檢疫對(duì)象,具有傳播速度快、致病性強(qiáng)、發(fā)病部位多、防治困難等特點(diǎn)。

    獼猴桃潰瘍病是目前無(wú)法根治的一種病害,以預(yù)防為主,一旦整株患病至末期只能進(jìn)行銷毀。近年獼猴桃苗木頻繁引種,檢疫把關(guān)不嚴(yán),導(dǎo)致獼猴桃潰瘍病在各地陸續(xù)發(fā)生[2],該病在全國(guó)范圍內(nèi)已報(bào)道的獼猴桃主產(chǎn)區(qū)都造成了嚴(yán)重的危害,感染Psa日趨嚴(yán)重,影響果實(shí)品質(zhì)和商品性,因此Psa的早期診斷、早期預(yù)防是預(yù)防大面積爆發(fā)獼猴桃潰瘍病的前提。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,獼猴桃潰瘍病的檢測(cè)主要是基于PCR原理,而常規(guī)的PCR技術(shù)并不能準(zhǔn)確區(qū)分檢測(cè)樣中病原菌的生存狀態(tài),導(dǎo)致檢測(cè)出假陽(yáng)性的結(jié)果,因而急需建立有效的檢測(cè)手段來(lái)鑒別Psa。本文闡述近年所采取的獼猴桃潰瘍病檢測(cè)技術(shù),以期為獼猴桃潰瘍病的快速檢測(cè)和防控研究提供參考。

    1 獼猴桃潰瘍病概況

    1.1 病原菌的生物學(xué)特性

    Psa為好氧菌,短桿狀或稍有彎曲的兩端鈍圓的革蘭氏陰性細(xì)菌,多數(shù)具有1根鞭毛,少數(shù)有2~3根鞭毛,不產(chǎn)芽孢,無(wú)莢膜。在牛肉膏培養(yǎng)基上菌落為乳白色、圓形、邊緣光滑,生長(zhǎng)緩慢;該菌喜好低溫、高濕及強(qiáng)光照;能在含有蔗糖的培養(yǎng)基上產(chǎn)生果聚糖,菌落呈現(xiàn)粘液狀。病菌對(duì)高溫適應(yīng)性差,15~25℃是最適宜生長(zhǎng)溫度。

    1.2 分布與危害

    獼猴潰瘍病是一種嚴(yán)重為害獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的毀滅性病害,該病于1980年在日本和美國(guó)首次發(fā)現(xiàn),此后相繼在中國(guó)、意大利、新西蘭等國(guó)發(fā)生。近年來(lái),在我國(guó)的陜西、四川、貴州、湖南、江蘇和浙江等16個(gè)省份發(fā)生流行、危害,獼猴桃主產(chǎn)區(qū)頻繁流行,發(fā)病普遍嚴(yán)重,嚴(yán)重地阻礙了我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

    1.3 危害癥狀

    病菌主要危害獼猴桃的主干、枝蔓、嫩梢、葉片及花蕾等部位,造成枝條枯死、整株死亡。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)國(guó)際間Psa的傳播可能是通過(guò)花粉、幼苗等進(jìn)出口方式進(jìn)行傳播。樹干或枝條在感病后凸起開裂,染病部位的皮層初期溢出乳白色菌膿,后期形成黃褐色或銹紅色粘液。感病葉片呈現(xiàn)褐色不規(guī)則或多角形病斑,周圍常伴有黃色暈圈。花蕾感病后,部分不能開花,花蕾變褐枯死。即使開花結(jié)果,果小易造成落果、畸形果。

    1.4 發(fā)生流行規(guī)律

    病菌多從枝蔓及枝條等部位侵入,主要借助風(fēng)雨、昆蟲、苗木攜帶或農(nóng)事操作進(jìn)行傳播。該病菌主要在病株組織中越冬,也可隨病殘?bào)w在土壤中越冬。獼猴桃潰瘍病屬于低溫、高濕病害,冬季及初春溫度的急劇變化,是導(dǎo)致潰瘍病發(fā)生流行的關(guān)鍵因子,低溫有利于該病發(fā)生,高溫阻礙其流行。

    1.5 綜合治理

    目前對(duì)獼猴桃潰瘍病的防控主要采用綜合治理措施,提前預(yù)防是防治其病害的關(guān)鍵。綜合治理包括:①加強(qiáng)植物檢疫工作。獼猴桃潰瘍病作為一種全國(guó)檢疫性森林病害,新建果園在栽培引種的過(guò)程中要確保外來(lái)苗木不攜帶潰瘍病菌。②加強(qiáng)栽培管理。加強(qiáng)冬季的清園防治工作,進(jìn)行農(nóng)事操作時(shí)避免造成大量傷口。③選育和利用抗病品種。目前,利用優(yōu)良的抗獼猴桃潰瘍病品種是控制該病害最為有效和經(jīng)濟(jì)的措施。④化學(xué)藥劑防治。使用化學(xué)藥劑是目前防治潰瘍病最主要、最直接的防治措施。國(guó)內(nèi)眾多研究者對(duì)潰瘍病的室內(nèi)及田間化學(xué)藥劑的篩選做了大量工作,對(duì)有效試劑的使用等有諸多研究成果。

    2 獼猴桃潰瘍病檢測(cè)技術(shù)研究概述

    2.1 直接PCR檢測(cè)技術(shù)

    李智念等[3]優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,無(wú)需病原物培養(yǎng)和DNA提取過(guò)程,直接以獼猴桃枝條為樣本進(jìn)行PCR,使用紫外手電筒代替凝膠成像系統(tǒng)來(lái)判斷。付博等[4]對(duì)獼猴桃潰瘍病快速檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化,樣品病健交界處用金氏B培養(yǎng)液浸泡以及PCR體系中加入10%甘油,提升擴(kuò)增效率。建立田間無(wú)癥狀樣本快速檢測(cè),無(wú)癥狀帶菌樣品浸提液中加入Na2SO3,為獼猴桃潰瘍病早期診斷提供技術(shù)支撐。

    2.2 RT-PCR

    劉蕓宏[5]應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)Psa-V活菌,對(duì)于染菌花粉樣品,增菌12h,靈敏度可達(dá)1.39×101CFU/g,該方法對(duì)陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)Psa-V活菌定量檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

    2.3 熒光定量PCR技術(shù)

    周大祥[6]研究疊氮溴乙錠EMA-qPCR是一種有效檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法,能有效避免PCR檢測(cè)實(shí)際樣品可能造成的假陽(yáng)性結(jié)果。劉蕓宏[5]采用疊氮溴化丙啶PMA-qPCR結(jié)合,優(yōu)化PMA最佳濃度為105μg/mL、培育時(shí)間為8min、曝光時(shí)間為20min,結(jié)果表明應(yīng)用人工染菌后的枝條樣品,最低檢出限為6.30×104CFU/mL。謝錦添[7]等根據(jù)hrpW基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物,擴(kuò)增片段247bp,該方法可檢測(cè)無(wú)病癥枝條中最低濃度8.45×10-5ng/μL的PSA病原菌,對(duì)獼猴桃潰瘍病感病樣品的早期診斷提供幫助。

    2.4 巢式PCR

    曹凡[8]以Gallelli檢測(cè)法為基礎(chǔ)改進(jìn)巢式PCR檢測(cè)技術(shù),對(duì)獼猴桃枝條、葉片、雄花Psa進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明有Psa典型癥狀的樣品陽(yáng)性率為76.67%,雄花Psa的陽(yáng)性率為55%。無(wú)Psa典型癥狀的樣品陽(yáng)性率為41.67%,雄花Psa的陽(yáng)性率為50%,該方法可以對(duì)早期Psa進(jìn)行鑒定。

    2.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)LAMP

    王一波等[9]設(shè)計(jì)優(yōu)化LAMP反應(yīng)的檢測(cè)體系,優(yōu)勢(shì)為特異性強(qiáng)、靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短以及結(jié)果可視化;能夠特異性檢測(cè)出Psa病原菌的靈敏度為100CFU/mL,LAMP能夠檢測(cè)獼猴桃潰瘍病不同的發(fā)病部位,該方法能夠廣泛應(yīng)用于田間的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病快速檢測(cè)。

    2.6 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

    郭麗倩[10]以獼猴桃潰瘍病菌為免疫原,通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備抗獼猴桃潰瘍病菌的單克隆抗體,以單抗為核心建立可特異、靈敏檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的ACP-ELISA、dot-ELISA血清學(xué)快速檢測(cè)技術(shù),該方法檢測(cè)病菌的極限分別為0.9×102和3.6×103CFU/mL,為我國(guó)獼猴桃潰瘍病的檢測(cè)診斷和科學(xué)防治提供技術(shù)支撐。

    3 討論

    雖然目前建立的Psa檢測(cè)的方法有很多,但也存在一些應(yīng)用推廣的缺點(diǎn),專業(yè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)具備專業(yè)人員和設(shè)備,而田間果農(nóng)不具備專業(yè)的設(shè)備和檢測(cè)技術(shù),而且PCR技術(shù)存在檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性,為了檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠,應(yīng)多種檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合。應(yīng)重視關(guān)于獼猴桃潰瘍病的早期檢測(cè),為獼猴桃潰瘍病菌的潛伏期診斷、種群動(dòng)態(tài)檢測(cè)以及植物檢疫工作提供技術(shù)參考。

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