淺析聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗中常見問題及解決方法

毛秀榮，李 雷，朱 俊，鄧繼武，石 榴，朱勇強，祝陳英，郭丹蝶

(四川省達州市種子管理站，四川 達州 635000)

種業(yè)提升計劃的推行，我國培育審定和登記的農(nóng)作物品種逐年增多，據(jù)報道，截止2018年底全國選育農(nóng)作物品種4萬多個。農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和消費市場的日益變化，品種更新?lián)Q代顯著加快，市場和產(chǎn)業(yè)基地中同名異物、同物異名、一物多名、一名多物，以假充真、魚目混珠等現(xiàn)象時有發(fā)生。同時，轉基因技術等新型育種技術的應用，使單一性狀的改變成為可能，在原品種基礎上改良少數(shù)或者單個性狀的派生性品種大大增加，這給品種的鑒定篩選、選育、保護及種質(zhì)資源的生產(chǎn)、經(jīng)營、管理、維權等帶來了不同程度的困難，甚至給農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟損失。學術和實踐中，基于基因表達型的形態(tài)學標記、孢粉學標記、細胞學標記和同工酶標記，以及直接反映DNA水平差異的分子標記都是較為常用的鑒定方法。但形態(tài)學標記易受環(huán)境條件與人為觀測因素影響，同時存在標記數(shù)量少、多態(tài)性差等缺點。孢粉學標記不適合用于同種不同品種間親緣關系的研究，在同種質(zhì)類型內(nèi)的意義不大。細胞學標記信息挖掘需要大量的人力和時間，而標記的數(shù)量有限；同工酶種類較少，且對不同果樹品種的鑒定能力不強，在實際應用中更是難以辨別出品系間的差異。分子標記最大的優(yōu)點是能夠準確且直接展現(xiàn)基因組DNA的差異，因而具有更高的準確性和穩(wěn)定性。為此，文章以筆者在聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗過程中遇到的實際問題為例，對問題產(chǎn)生的原因和可能的解決辦法進行了探討分析，以期為聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗的順利開展和真實數(shù)據(jù)的獲得提供啟示和幫助。

1 條帶圖譜不理想

1.1 未檢測到目標條帶

未檢測到目標條帶甚至無條帶，最可能出現(xiàn)的原因一是PCR產(chǎn)物跑出凝膠；二是PCR未有效擴增，未獲得足夠有效的PCR產(chǎn)物。問題一解決思路是降低產(chǎn)物在PAGE膠中的移動速度，可降低電壓、縮短電泳時間，參考maker條帶的在凝膠的位置，結合目標條帶的大小，判斷是目標條帶否跑出凝膠。接通電源，在5V/cm(長度以兩個點極之間的距離計算)條件下電泳30～40min，切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣孔的一端)。問題二解決思路，首要保障引物質(zhì)量，確定PCR反應體系的配置，包括模板、引物、MIX混合液和水的配置比例等，其次是PCR擴增程序是否合理，引物的來源，建議通過一級數(shù)據(jù)庫NCBI、GDR等(原始文獻)查詢獲得。

1.2 出現(xiàn)非特異性擴增帶

在真實性實驗中，非特異性條帶并不是我們想要的，非特異性擴增帶的出現(xiàn)最可能的原因一是引物的選擇，二是引物的退火溫度，三是PCR擴增循環(huán)次數(shù)過大，PCR擴增過程中延伸時間過長，循環(huán)數(shù)多，非特異性產(chǎn)物量也隨之增多。問題一、二解決思路是要找到最適合的引物，以高差異性品種為模板，通過多次引物適宜性和多態(tài)性篩選，選取合適的引物。同時，以0.5～1℃為梯度，篩選最適合退火溫度(可將退火溫度相近的引物一起篩選，提高效率)。問題三可適當減少PCR循環(huán)次數(shù)，適當提高退火溫度，使得擴增產(chǎn)物穩(wěn)定，在實際實驗中經(jīng)過多次對比分析，35個循環(huán)較為合適。

1.3 出現(xiàn)拖帶或彌散

出現(xiàn)這種情況的原因是多方面的，聚丙烯膠在配置過程中未充分混勻，導致分離效果不明顯，出現(xiàn)條帶彌散。所以配置聚丙烯膠時一定要仔細，不可漏加，少加藥品，還需充分搖勻。電泳液也要勤換，這樣才能保證電泳效果；同時，點樣時只圖速度，所點樣品飄散在加樣孔，也造成圖譜拖帶或者空白。因此，移液槍點樣一般1～3μL，且速度要緩慢，注意盡量不要吸到石蠟油，待樣液自然落入樣孔底部，所得帶型清晰、美觀。

1.4 出現(xiàn)圖譜很淡，呈灰色

問題可能是一PCR擴增產(chǎn)物量過少，二是銀染時間不足。擴增產(chǎn)物不足，可以選擇增加點樣量，一般108孔的可以選擇0.8～1.2uL，孔越大加樣量越大?？紤]硝酸銀易吸水和見光分解，可適當提高硝酸銀溶液的濃度，延長染色的時間，及時將使用后的硝酸銀置于棕色瓶低溫避光保存。顯色液配置時要先加氫氧化鈉，待后氫氧化鈉溶解完全溫度降低室溫時再加入甲醛，低溫保存，減少甲醛揮發(fā)，保證顯影液質(zhì)量。搖床晃動染色、顯色時，用純水沖洗過的玻璃棒將重疊在一起的膠塊輕輕撥開，使得每塊膠均勻染色，以保證圖譜質(zhì)量和清晰度。

1.5 條帶彎曲、不整齊

問題可能一是聚丙烯酰氨凝膠不均勻，二是電泳液緩沖能力下降。問題一的解決思路:均勻制作凝膠版，可先將膠液、凝固劑、加速劑分別配置母液，使用時在稀釋混勻。在實際操作中，通過灌膠時適當加大電泳槽傾斜角、減緩灌膠速度，減少膠中的氣泡。制作好的膠放入垂直電泳槽時，從一邊緩緩浸入，排除膠板底部間隙氣泡，確保兩邊受力一致，避免膠帶損壞。電泳液使用時間較長，離子濃度降低，pH上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。問題二的解決思路:建議配置好的緩沖液用PH試紙測溶液強度，連續(xù)使用，每星期更換1次電泳緩沖液最佳。

2 DNA質(zhì)量控制不當

2.1 DNA溶液反復凍融

由于基因組DNA反復凍融，導致DNA含量下降。因此建議對提取的DNA分裝保存，需要使用時取出，融化后應該立即使用，使用結束后，剩余DNA及時于4℃冰箱中保存。同時，DNA存放時間不宜超過14d，時間過長導致降解，試驗徒勞無功。

2.2 DNA質(zhì)量不高

由于陳種子提取的DNA純度低，擴增效果差，導致結果不明顯或者帶型不一致的，干擾結果分析。采取室內(nèi)發(fā)芽獲取幼嫩植物組織，CTAB法提取DNA。也可采集鮮葉放于自封袋中，并加入100-200 g變色硅膠，使硅膠與葉片的質(zhì)量比在20:1左右，同時輕微搖動使硅膠與葉片接觸充分、均勻，常溫放置，可長時間保存用于DNA提取。DNA提取后應當進行質(zhì)量檢測，一是通過1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶亮度、形狀，有無彌散、拖尾、蛋白污染等。二是通過濃度檢測，一般合格的DNAOD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA較純。幼苗提取的DNA濃度較高，需要稀釋20ng/μL備用，原液置于-20℃保存，稀釋液置于4℃保存使用。

3 點樣過程不規(guī)范

3.1 點樣不方便

由于購買的樣梳齒子太長，點樣孔過深，長槍頭不能觸及樣孔底部，樣液不能全部、快速落入底部，所得圖譜不夠清晰，影響圖譜分析。在實際實驗中可用剪刀剪去樣梳齒子長度的四分之一，這樣移液槍點樣時，樣品自然、快速落入底部，不會彌散在孔中，提高了圖譜分析時的辨識度。

3.2 點樣方法不當

點樣前注意移液槍吸樣，將搶頭伸到底部，吸樣后稍停留待長頭搶充分吸取樣液，再加入樣孔底部；點樣時，為避免邊緣效應，最好左右兩端空幾個點樣孔，然后再加樣，這樣可以避免兩邊膠孔拔時斷裂，加樣串孔。在實驗中如有多人，大批量做檢驗，必須用maker做好標記，膠板左、中、右部分至少留有一條Maker，以便分析條帶，比對圖譜。

4 引物存放不當

制作模板時，稍有不慎可能會有不換槍頭吸取另一引物的情況，此時就造成了引物整管污染，出現(xiàn)雜帶，干擾結果分析；引物多次反復凍融，會使得其存放時間變短，所得圖譜明顯沒有剛開始亮。為防止不規(guī)范操作造成引物污染及多次凍融導致引物變質(zhì)降解，我們將稀釋后的前后引物混合并裝，可有效減少加樣次數(shù)，在-20℃冰箱保存，就可避免整管被污染和反復凍融失效。

5 硝酸銀用量不當或存放過長失效

在染色時，應待硝酸銀完全溶解并混勻后才可倒入，否則銀顆粒會潛入膠中，使得背景雜亂。硝酸銀量不足會使DNA帶變淺，硝酸銀失效，導致膠板變空白；量過多，導致較多銀離子殘留在膠板上，背景深而影響顯帶。因此，在試驗中若染色不佳，可適當?shù)亩嗉酉跛徙y或適當?shù)难娱L染色時間，以保證染色效果。

6 膠帶的長期保存

顯色完全用后清水洗去殘留的顯影液和硝酸銀液后，可以用保鮮薄膜將膠帶完全包裹，并用除去膠帶上多余的水，用馬克筆在膜上記下相關重要信息，置于低溫下可長時間保存?zhèn)溆谩?/p>

聚丙烯酰氨凝膠電泳檢驗檢測準確性高、實用性強，但試驗步驟繁瑣，耗時較長，因此，檢驗人員在聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗過程中必須嚴謹、細致，需進一步加強專業(yè)素養(yǎng)，提升操作技能，為品種檢測、鑒定把好質(zhì)量關。