Sonic hedgehog信號通路中Gli蛋白活化和腫瘤相關(guān)性的研究進展*

曾莉莉， 董洪亮， 陳微微， 馬向瑞， 杜 靜△

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1口腔頜面外科3醫(yī)學(xué)研究中心，濱州 256600 2濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院(煙臺)，煙臺 264000

Hedgehog(Hh)信號通路第一次被發(fā)現(xiàn)是在對果蠅胚胎發(fā)育的研究當(dāng)中，Nusslein-Volhard和Wieschaus兩位學(xué)者在研究果蠅的胚胎致死突變體中首先分離鑒定出了Hedgehog基因[1]。該信號通路在結(jié)構(gòu)和功能上都非常保守，是一種配體依賴性信號通路，并且它還參與了脊椎動物的多種生物學(xué)過程，包括胚胎發(fā)育、細胞生長分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展等[2]。多項研究結(jié)果表明，Sonic hedgehog(Shh)信號通路是參與體內(nèi)多種癌癥發(fā)生發(fā)展的Hh信號通路中的重要組成成分，而神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homologue，Gli)也被證明在Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮了不可或缺的作用。這些年來，針對該信號通路的靶向抑制劑研發(fā)成功的案例越來越多，使得Shh信號通路與腫瘤的關(guān)系再次進入學(xué)者們的視野。本文將就Shh信號通路中的Gli蛋白與腫瘤的相關(guān)性以及Gli蛋白靶向抑制腫瘤的研究進展作一總結(jié)。

1 Sonic hedgehog信號通路

此前在脊椎動物中已經(jīng)檢測出3個果蠅同源Hh基因，它們都可以編碼一種叫做Hh配體的糖蛋白，這種蛋白同時還具有分泌功能和自我催化能力[3]。其中，Sonic hedgehog(Shh)在神經(jīng)系統(tǒng)、肺和牙齒的發(fā)育過程中廣泛表達，對其形態(tài)發(fā)育和功能形成發(fā)揮了關(guān)鍵作用[4-6]；Indian hedgehog(Ihh)在軟骨和骨骼的生長發(fā)育當(dāng)中起著重要調(diào)控作用[7]；Desert hedgehog(Dhh)主要在睪丸中表達，是哺乳動物精子發(fā)生中的重要調(diào)控因素[8]。Sonic hedgehog(Shh)信號通路的主要成員包括Shh配體、跨膜蛋白受體Patched(Ptch)、跨膜蛋白Smoothened(Smo)、核轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白、Fu抑制劑(suppressor of fused，SuFu)及下游靶基因。Shh配體首先是以前體蛋白的形式生成，在經(jīng)歷了自蛋白水解作用、膽固醇修飾和進一步的棕櫚?；燃庸ず蟛啪哂袀鬟f信號的活性作用。氨基端(Shh-N)及羧基端(Shh-C)的兩個結(jié)構(gòu)域是由Shh前體的自我裂解產(chǎn)生，其中Shh-N的COOH末端共價結(jié)合1個膽固醇分子[9]，然后酰基轉(zhuǎn)移酶將棕櫚酰部分添加到N末端的半胱氨酸，生成雙重修飾的成熟的Shh蛋白[10]。繼而可以在局部分泌，也可以進行長距離擴散。Ptch和Smo是Shh信號向下傳遞的關(guān)鍵分子，錨定于靶細胞的細胞膜上。Ptch是一種12次跨膜蛋白，由腫瘤抑癌基因Patched編碼[11]。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了的脊椎動物Ptch同源物一共有Ptch1和Ptch2兩種。而Smo受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體類似結(jié)構(gòu)的7次跨膜蛋白，由原癌基因Smothened編碼[12]。Gli蛋白是具有高度保守的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kruppel樣因子家族的成員之一，作為Shh信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控作用[13]。Gli1、Gli2和Gli3是目前為止已經(jīng)鑒定出來的3種脊椎動物Gli蛋白同源物，在這三者之中Gli1是主要激活劑，Gli2和Gli3則充當(dāng)激活劑和抑制劑的雙重角色[14]。Shh信號通路本身的重要成員也是其最主要的下游靶分子，包括Ptch1、Ptch2和Gli1基因。Ptch1、Ptch2和Gli1可以作為Shh信號通路激活的可靠指標(biāo)，并起到負調(diào)控(Ptch1)和正調(diào)控(Gli1)的作用[15]。

脊椎動物中Shh信號向下傳遞時，它在細胞內(nèi)亞細胞器的位置會隨時發(fā)生改變，主要在初級纖毛或纖毛附近聚集。初級纖毛是位于脊椎動物細胞表面突出的部分，作為Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號中心發(fā)揮作用。當(dāng)沒有Shh配體存在時，Smo的活性被Ptch抑制，從而不能順利進入纖毛發(fā)揮激活作用。Gli則與SuFu組成蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物被蛋白酶水解并釋放出Gli阻遏物(GliR)，同時SuFu抑制細胞質(zhì)中的Gli蛋白并促進其與轉(zhuǎn)錄共抑制因子的結(jié)合，進而導(dǎo)致目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄抑制[16]。當(dāng)有Shh配體與Ptch結(jié)合時，Smo的抑制作用被去除，同時也激活Smo離開胞膜進入原纖毛[17]，加速了Gli蛋白與SuFu的解離入核，從而引起下游靶分子一系列的轉(zhuǎn)錄活動[18]。Shh信號的異常激活可分為Shh依賴型和Shh非依賴型，同時又被稱為經(jīng)典型和非經(jīng)典型。Shh信號通路成分的突變是非依賴型的主要發(fā)生形式之一，比如Ptch基因和Smo基因的突變可以導(dǎo)致基底細胞痣綜合征[19-20]，SuFu突變可以導(dǎo)致髓母細胞瘤的發(fā)生[21]。見圖1。

圖1 脊椎動物中的Shh信號通路Fig.1 The sonic hedgehog signal pathway in vertebrates

2 Gli蛋白

Gli蛋白是Kruppel樣因子家族的成員，脊椎動物中含有的3種Gli蛋白都具有上游的N端結(jié)構(gòu)域、中央高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc-finger domain，ZFD)以及下游的C端結(jié)構(gòu)域，三者N端和C端結(jié)構(gòu)域的不同決定了3種蛋白各自功能的獨特性。此外，它們都含有一個核定位信號(nuclear localization signal，NLS)、核輸出信號(nuclear export signal，NES)和SuFu結(jié)合域(SuFu binding domain)。Gli1缺少阻遏物域，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄受其C末端反式激活域(transactivation domain，TAD)中的多個區(qū)域調(diào)控，Gli1的C末端TAD區(qū)(539～1106 aa)具有非常強的轉(zhuǎn)錄活性。SMARCA2是Gli1活性的共激活因子，它與Gli1-TAD中的特定結(jié)構(gòu)域相互作用而激活其轉(zhuǎn)錄活性[22]，而Gli2和Gli3是通過其N端的阻遏結(jié)構(gòu)域(repressor domain，RED)來調(diào)節(jié)活性。Sasaki等[23]的研究很好地證明了這一點，他們在培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細胞系MNS70中截斷一半的C末端激活域，產(chǎn)生了具有阻遏物活性的蛋白質(zhì)，而N末端的抑制域被去除時，則將Gli2轉(zhuǎn)化為強激活劑。在Gli3中也發(fā)現(xiàn)了涉及N末端區(qū)域的類似調(diào)節(jié)機制，而在Gli1中卻沒有發(fā)現(xiàn)。Gli2同時含有阻止和激活結(jié)構(gòu)域，但是其加工成抑制形式Gli2R的效率低下以及容易被蛋白酶體降解，因此大多數(shù)情況下Gli2充當(dāng)了激活轉(zhuǎn)錄因子的角色。Gli3包含一個位于C末端大約200個殘基的加工決定簇域(processing determination domain，PDD)，因此可以有效加工成阻遏物Gli3R[24]?？偟膩碚f，Gli1激活特定目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，而Gli2和Gli3則充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子(全長，以Gli2為主)或C端截短的阻遏物(以Gli3為主)。見圖2。

圖2 Gli蛋白的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of Gli protein

Gli蛋白在翻譯后被廣泛修飾，這些修飾很大程度上決定了它們在細胞中的運輸以及最終的轉(zhuǎn)錄輸出形式。磷酸化是目前研究最多最徹底的Gli蛋白修飾，其中多種激酶都與Gli蛋白的活性調(diào)節(jié)相關(guān)，包括糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)、雙特異性酪氨酸調(diào)節(jié)激酶(dual-specificity tyrosine-regulated kinases，DYRKs)和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)等。Gli蛋白活性受脊椎動物Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的多位磷酸化控制，它調(diào)節(jié)控制阻遏物(GliR)和激活物(GliA)形式的產(chǎn)生，PKA含有的6個Gli蛋白磷酸化位點(P1～P6)是其轉(zhuǎn)錄活性的決定因素[25]。具體而言，在不存在Shh配體的情況下，PKA使Gli2/3上的位點P1～P6磷酸化，隨后CK1和GSK3β磷酸化，從而觸發(fā)蛋白酶體加工成GliR抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活[26]。Gli1蛋白不經(jīng)歷PKA依賴型蛋白水解加工成阻遏物，但其PKA位點S544和S560也參與抑制Gli1的活性[27]。DYRKs也可以參與調(diào)節(jié)Gli蛋白的活性，Ehe等[28]研究發(fā)現(xiàn)DYRK1A可以直接參與調(diào)節(jié)Gli1蛋白在Ser408處的磷酸化，促進Gli1在細胞核中的定位及其轉(zhuǎn)錄活性。另一方面，DYRK1B通過阻止其蛋白酶體降解來增強Gli1蛋白的穩(wěn)定性[29]。除此以外，Han等[30]通過體內(nèi)和體外實驗證明Fused/Unc-51 like kinase(Fu/ULK)激酶家族能夠介導(dǎo)Gli蛋白的磷酸化和激活。

除了蛋白激酶以外，蛋白磷酸酶在調(diào)節(jié)Shh信號傳導(dǎo)中的作用也不容小覷，尤其是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，因為Shh途徑中大多數(shù)已知的磷酸化事件可以在絲氨酸或蘇氨酸殘基上發(fā)生。在真核生物中，蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2，PP2A)和蛋白磷酸酶4(protein phosphatase 4，PP4)都有表達，它們作用于Shh信號通路不同的位置[31]。PP2A是Shh途徑中最受研究關(guān)注的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。PP2A負調(diào)控Gli3蛋白，主要參與Gli3的核定位和轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)[32]，但其具體作用于Gli3的哪個位點目前還不是很清楚。同時蛋白磷酸酶4(protein phosphatase 4，PP4)也可以通過促進SuFu的去磷酸化增強Gli1的轉(zhuǎn)錄活性[33]。

3 Gli和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

Shh信號通路對于正常組織細胞的生長分化起著不可或缺的調(diào)控作用，一旦某一基因成分發(fā)生突變或異常就會激活該信號通路。大量研究顯示人體多種腫瘤的形成都涉及Shh信號通路的異常，其中Gli蛋白可能通過增強癌細胞的增殖、存活、干性、轉(zhuǎn)移潛力或刺激基質(zhì)和血管形成而促進癌變或加速腫瘤生長。

3.1 腫瘤發(fā)生

已有研究證實多種正常人體組織細胞的致癌過程都存在Gli蛋白激活入核。最近的一項對乳腺癌細胞中Gli蛋白與雌激素受體(estrogen receptor，ER)的研究表明，雌激素受體可以與Gli3結(jié)合并激發(fā)其活性，并且Gli3是乳腺癌細胞生長所必需的[34]。此外，有學(xué)者通過免疫組織化學(xué)的方法比較了卵巢高級別漿液性腺癌組織與正常輸卵管組織中的Shh信號激活情況，發(fā)現(xiàn)卵巢高級別漿液性腺癌組織中Gli1的表達量比正常輸卵管顯著增加[35]。同樣，在對36例小細胞肺癌的石蠟組織進行免疫組化分析時發(fā)現(xiàn)12例中的Gli1蛋白表達比例較高，且Shh過度表達與預(yù)后不良相關(guān)[36]。以上研究都充分說明了Gli蛋白參與了多種腫瘤的發(fā)生，并在相關(guān)腫瘤中明顯高表達。

3.2 腫瘤進展(轉(zhuǎn)移)

Gli蛋白的激活不僅涉及腫瘤的發(fā)生，還與腫瘤的進展有關(guān)。Ke等[37]的一項研究證明在胃癌組織中存在有Shh/Gli1途徑異常激活的情況，并可能通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進胃癌細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移，其中伴隨著Gli1的表達上調(diào)。此外，另有一項研究結(jié)果提示Shh/Gli1和Wnt/β-catenin途徑的激活可以促進黑色素瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成[38]。

3.3 腫瘤耐藥

多重耐藥是影響抗腫瘤治療效果的不利因素，因此尋求能夠逆轉(zhuǎn)多重耐藥的小分子化合物成為當(dāng)前亟須解決的重要問題。目前有許多學(xué)者都在積極地探尋引起腫瘤耐藥的機制，以便更好地針對性逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象。Yu等[39]的一項研究表明，Gli1介導(dǎo)的側(cè)群調(diào)節(jié)可能是胃癌耐藥的原因。另外一項研究發(fā)現(xiàn)Smo基因擴增和Shh通路激活是人類肺癌抗表皮生長因子受體藥物的新耐藥機制[40]。

一項探討Hedgehog/Gli1信號通路在調(diào)節(jié)骨肉瘤順鉑耐藥中相關(guān)作用的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1在骨肉瘤細胞的順鉑耐藥中起促進作用[41]，Gli1也能夠直接介導(dǎo)結(jié)直腸癌治療中氟尿嘧啶的耐藥性[42]，因此降低Gli1的表達量有望成為一種新方法，從而逆轉(zhuǎn)多重耐藥性和增加化療成功率。目前也有針對腫瘤耐藥的小分子抑制劑出現(xiàn)，溴結(jié)構(gòu)域抑制劑IBET-151可以通過降低Gli信號來抑制vismodegib(Smo抑制劑)耐藥的食管腺癌生長[43]。

4 Gli和腫瘤干細胞

目前腫瘤治療的最大難題還是原發(fā)腫瘤經(jīng)手術(shù)切除后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其中癌癥干細胞(cancer stem cell，CSC)是腫瘤抵抗力和復(fù)發(fā)的主要來源。大量研究表明，Shh通路參與調(diào)節(jié)包括前列腺癌[44]、肺癌[45]、乳腺癌[46]和白血病[47]等多種腫瘤干細胞的維持，促進其自我更新。Gli蛋白通過調(diào)節(jié)干細胞性相關(guān)基因同源盒蛋白(nanog homeobox，NANOG)，性別決定區(qū)Y-box蛋白2轉(zhuǎn)錄因子(sex-determining region Y-box protein 2，SOX2)，myc原癌基因蛋白(myc proto-oncogene protein，c-Myc)和八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer binding transcription factor 4，Oct-4)等的表達而有助于CSC的自我更新[48]。例如，Gli1介導(dǎo)的SOX2調(diào)節(jié)可以促進肺癌干細胞樣細胞的自我更新，并使其在長時間的臨床治療過程中獲得對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑的耐藥性[49]。此外，Gli蛋白還可以通過靶向NANOG來影響上皮性卵巢癌的干性及惡性程度[50]。因此，有學(xué)者提出通過化療可以影響腫瘤微環(huán)境的改變從而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Gli1的表達，進而導(dǎo)致腫瘤干細胞樣特征的誘導(dǎo)和卵巢癌的轉(zhuǎn)移。因此抑制Gli1就可能逆轉(zhuǎn)化療后CSC樣特征加重并阻止卵巢癌細胞遷移[51]。

5 針對Gli蛋白的靶向治療

如今市場上已經(jīng)有許多靶向Shh信號途徑的抑制劑出現(xiàn)，大多數(shù)都屬于Smo抑制劑。其中LDE225/sonidegib和GDC-0449/vismodegib兩種Smo抑制劑在基底細胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的臨床治療中都取得了不錯的效果，因此被FDA批準(zhǔn)用于治療該類患者。但是，也有一些使用了Smo抑制劑的患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)及耐藥現(xiàn)象，其可能與Shh通路重新激活有關(guān)，主要原因是藥物靶標(biāo)Smo的突變，也有部分是因為同時改變SuFu和Gli2的拷貝數(shù)造成的[52]。這表明需要以靶向Shh通路多個水平上成分的療法組合來克服耐藥性。因此，Smo下游的Gli抑制劑就成為了研究關(guān)注的重點。

GANT61是目前針對Gli1和Gli2的小分子拮抗劑，它在細胞核中阻止Gli與高度保守的DNA序列結(jié)合，其中GANT61對Gli1的特異性更高。在GANT61處理的細胞中Gli1的DNA結(jié)合顯著降低，這表明GANT61可能會誘導(dǎo)Gli1的翻譯后修飾，從而阻止DNA結(jié)合或破壞Gli1-DNA復(fù)合物的穩(wěn)定[53]。而Dash等[54]篩選出一種Gli1高親和力的小分子抑制劑8-羥基喹啉，它不會阻止Gli1與DNA的結(jié)合，也不會破壞Gli1-DNA復(fù)合物，而是誘導(dǎo)整個復(fù)合物中的特定構(gòu)象變化，從而阻止Gli的正常功能。目前，GANT61在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌和口腔鱗狀細胞癌中都已顯示出靶向Gli的特異性抑制作用[55-58]。另外，三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)也顯示出對Gli的抑制性，它通過下調(diào)Gli1的表達來抑制腫瘤干細胞樣細胞發(fā)揮作用[59]，也有學(xué)者指出ATO通過取代Gli鋅指蛋白中的鋅離子而使Gli1鋅指肽結(jié)構(gòu)重組，從而使其失活抑制Shh通路[60]。靶向Gli的其他抑制劑還包括有撲蟯靈(Pyrvinium)、吡非尼酮(Pirfenidone)和咪喹莫特(Imiquimod)等，目前只有ATO、吡非尼酮和咪喹莫特已經(jīng)進入了不同類型癌癥的臨床試驗，其余藥物還需要經(jīng)歷一段時間的深入研究才能投入到安全使用當(dāng)中。

6 總結(jié)和展望

在Shh信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中Gli1發(fā)揮著最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其表達激活可以通過多種不同的途徑來促進癌癥的發(fā)生與進展。如今大量的研究結(jié)果都證實了靶向Gli1蛋白可以阻止人體多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但Gli蛋白到底是如何發(fā)揮其調(diào)控作用還有待于更加深入的研究。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有多種靶向Shh信號通路的小分子抑制劑正在研發(fā)或使用，但其臨床治療效果還不是很顯著，還需要進行更多的臨床試驗進行驗證，尤其是靶向Gli蛋白的抑制劑的臨床應(yīng)用。