膽囊收縮素通過膽囊收縮素受體A減弱炎癥反應(yīng)降低脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷*

譚 媛， 廖勇杰， 岳嗣鳳

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，桂林 541001

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)表現(xiàn)為胸部X線片顯示雙側(cè)肺彌漫性浸潤，動(dòng)脈血氧分壓與吸入血氧濃度比值(PaO2/FiO2)≤300 mmHg和肺動(dòng)脈楔壓(PAWP)≤18 mmHg或臨床無左心房高壓證據(jù)。根據(jù)PaO2/FiO2比值差異分為輕度、中度、重度急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，PaO2/FiO2≤300 mmHg為輕度；PaO2/FiO2≤200 mmHg為中度；PaO2/FiO2≤100 mmHg為重度。ALI發(fā)生過程中，炎癥紊亂導(dǎo)致肺內(nèi)皮和上皮屏障破壞，其細(xì)胞層面變化表現(xiàn)為肺泡-毛細(xì)血管膜完整性喪失，中性粒細(xì)胞過度遷移并引起促炎因子釋放[1]。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒ARDS發(fā)展進(jìn)程迅速，死亡率高，而早產(chǎn)兒由于肺部發(fā)育不完全，肺部更易受損[2-4]，肺部感染引發(fā)炎癥同樣是新生兒ARDS的重要發(fā)病原因之一[2]。新生兒急性呼吸衰竭(包括ARDS、肺炎等)也常常伴有過度炎癥反應(yīng)，更有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制炎癥反應(yīng)有助于減輕新生幼仔肺損傷[5-6]。

膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種多肽類激素，其受體有兩種，包括膽囊收縮素受體A(cholecystokinin A receptor，CCKAR)和膽囊收縮素受體B(CCKBR)[7]。研究發(fā)現(xiàn)CCK能通過抑制炎癥和細(xì)胞凋亡保護(hù)小鼠肝臟缺血再灌注損傷，同時(shí)其受體CCKAR表達(dá)上調(diào)[8]。但CCK與CCKAR是否參與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的ALI仍未見報(bào)道。近年來，隨著生物科技的飛速發(fā)展，各種新興手段如基因芯片、高通量篩選等被廣泛應(yīng)用于ALI發(fā)病分子機(jī)制研究[9]。本研究利用生物信息學(xué)手段預(yù)測發(fā)現(xiàn)CCKAR與LPS誘導(dǎo)的ALI相關(guān)，并探討CCK及CCKAR對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自武漢普諾賽生命科技有限公司；支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液(BEGM)Bullet Kit購自Lonza公司；CCK、LPS、MTT試劑及拮抗劑丙谷酰胺(Proglumide)均購自Sigma公司；兔抗人一抗CCKAR、phospho-p65(p-p65)、p65、GAPDH購自Abcam公司，兔抗人一抗phospho-IκB(p-IκB)、IκB和山羊抗兔二抗蛋白抗體購自Cell Signaling Technology公司；BCA試劑盒和RIPA蛋白裂解液購自南京碧云天生物技術(shù)公司；ECL發(fā)光檢測試劑盒購自上海愛必信生物科技有限公司；人IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA Kit購自R&D System公司；過表達(dá)質(zhì)粒載體(pcDNA3.1)購自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心；Trizol試劑，SuperScriptTMⅣ第一鏈合成系統(tǒng)，PowerUpTMSYBRTMGreen預(yù)混液購自Thermo-Fisher Scientific公司；CCKAR引物：F5′-GACGC-TTCGGTCATTAGA-3′，R5′-GACGCTTCGGTC-ATTAGA-3′；β-actin引物：F5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，R5′-ACTCGTCATACTCCTG-CTTG-3′購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 使用BEGM Bullet Kit培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞，孵育箱培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2。當(dāng)細(xì)胞生長至約80%匯合度時(shí)，使用0.25%胰酶消化細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將BEAS-2B細(xì)胞分為6組：未經(jīng)任何處理的細(xì)胞為空白對照組(Control)；利用LPS(1 mg/L)誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞24 h，并命名為LPS處理組(LPS)；將過表達(dá)空載體轉(zhuǎn)染至BEAS-2B細(xì)胞后，使用LPS(1 mg/L)處理24 h，并命名為CCKAR過表達(dá)陰性對照組(LPS+OE-NC)；將CCKAR過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至BEAS-2B細(xì)胞中，使用LPS(1 mg/L)處理24 h，并命名為CCKAR過表達(dá)組(LPS+OE-CCKAR)；BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)CCK(10-6mol/L)處理1 h后，使用LPS(1 mg/L)進(jìn)行24 h誘導(dǎo)，并命名為CCK過表達(dá)組(LPS+OE-CCK)；BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)CCK(10-6mol/L)和Proglumide(25 μg/mL)共處理1 h后，使用LPS(1 mg/L)進(jìn)行24 h誘導(dǎo)，并命名為CCK與CCK拮抗劑組(LPS+CCK+Proglumide)。

1.2.2 RT-PCR法檢測基因表達(dá)水平 利用TRIzol裂解液提取細(xì)胞中的總RNA，依據(jù)說明書，使用SuperScriptTMⅣ第一鏈合成系統(tǒng)合成cDNA，使用PowerUpTMSYBRTMGreen檢測CCKAR在不同分組中的相對表達(dá)水平。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 利用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。30 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育2 h。使用ECL發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行顯色，曝光。使用Image J軟件對蛋白灰度進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 構(gòu)建過表達(dá)CCKAR細(xì)胞株 使用SuperScriptTMⅣ第一鏈合成系統(tǒng)獲得CCKAR cDNA，按照說明書將cDNA插入到pcDNA3.1質(zhì)粒載體上，形成pcDNA3.1-CCKAR過表達(dá)載體，再依據(jù)Lipofectamine 2000說明書將過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至BEAS-2B細(xì)胞中。

1.2.5 ELISA檢測炎癥因子水平 依據(jù)說明書使用ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α在細(xì)胞上清培養(yǎng)液中的分泌水平。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取GSE18341和GSE2411表達(dá)數(shù)據(jù)。選取GSE18341芯片中未處理組小鼠(4個(gè)樣本；16周)和LPS誘導(dǎo)組小鼠(4個(gè)樣本)，以及GSE2411芯片中Control組小鼠作為對照組(6個(gè)樣本)和LPS組小鼠作為實(shí)驗(yàn)組(6個(gè)樣本)，應(yīng)用GEO在線分析工具GEO2R對各自芯片中的對照組和試驗(yàn)組進(jìn)行差異分析，以|logFC| > 1.5，P<0.05為篩選條件獲得差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

通過GEO數(shù)據(jù)庫平臺檢測，GSE18341和GSE2411數(shù)據(jù)集符合研究標(biāo)準(zhǔn)。對兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行GEO2R差異分析，分別篩選出238個(gè)和120個(gè)DEGs，其中GSE18341有220個(gè)上調(diào)基因，18個(gè)下調(diào)基因(圖1A，P<0.05)；GSE2411有116個(gè)上調(diào)基因，4個(gè)下調(diào)基因(圖1B，P<0.05)。利用韋恩圖對兩個(gè)數(shù)據(jù)集獲得的DEGs取交集，發(fā)現(xiàn)有80個(gè)共同DEGs(圖1C)。CCKAR是共同下調(diào)表達(dá)基因，并且在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中下調(diào)最為顯著。

A：GSE18341中DEGs火山圖；B：GSE2411中DEGs火山圖；C：GSE18341和GSE2411 DEGs的韋恩圖圖1 GSE18341和GSE2411中差異表達(dá)基因Fig.1 Identification of differentially expressed genes(DEGs)in GSE18341 and GSE2411

2.2 過表達(dá)CCKAR降低LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞存活率和炎癥反應(yīng)

RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)24 h后，CCKAR表達(dá)水平下調(diào)(圖2A、2B，P<0.01)，并且細(xì)胞存活率顯著下降(圖2C，P<0.01)；與LPS+OE-NC組相比，CCKAR在LPS+OE-CCKAR組中的表達(dá)水平顯著升高(圖2D、2E，均P<0.01)，并且細(xì)胞存活率顯著上調(diào)(圖2C，P<0.05)。ELISA結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)后，BEAS-2B細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖2F，均P<0.01)；與LPS+OE-NC組相比，CCKAR過表達(dá)后LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)水平明顯下調(diào)(圖2F，均P<0.01)。

1：空白對照組；2：LPS組；3：LPS+OE-NC組；4：LPS+OE-CCKAR組；A：RT-PCR檢測CCKAR mRNA表達(dá)水平；B：Western blot檢測CCKAR蛋白表達(dá)水平；C：MTT檢測細(xì)胞活力；D：RT-PCR檢測CCKAR mRNA表達(dá)水平；E：Western blot檢測CCKAR蛋白表達(dá)水平；F：ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6和水平；*P<0.05 **P<0.01圖2 CCKAR在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)中的作用Fig.2 Role of CCKAR in LPS-induced cell injury and inflammation

2.3 過表達(dá)CCKAR激活NF-κB信號通路

與空白對照組相比，LPS誘導(dǎo)后p-p65/p65和p-IκB/IκB表達(dá)比值顯著上調(diào)(圖3，均P<0.01)，而過表達(dá)CCKAR顯著抑制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中的p-p65/p65和p-IκB/IκB表達(dá)比值(圖3，均P<0.01)。

1：空白對照組；2：LPS組；3：LPS+OE-NC組；4：LPS+OE-CCKAR組；**P<0.01圖3 CCKAR在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞對NF-κB信號通路的影響Fig.3 Effect of CCKAR on NF-κB signaling pathway in LPS-induced cells

2.4 CCK通過上調(diào)CCKAR減弱LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)

RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與LPS單獨(dú)誘導(dǎo)組相比，LPS和CCK共處理導(dǎo)致CCKAR表達(dá)水平顯著上升(圖4A、4B，均P<0.01)。同時(shí)，CCK處理顯著提高細(xì)胞存活率，抑制LPS對細(xì)胞存活率的影響(圖4C，P<0.01)；而CCK和CCK拮抗劑Proglumide共處理導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降(圖4C，P<0.05)。CCK處理后有效抑制了LPS引起的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)上調(diào)(圖4D，均P<0.01)；而同時(shí)加入Proglumide后，CCK對炎癥因子水平的影響受到抑制(圖4D，均P<0.01)。

1：空白對照組；2：LPS組；3：LPS+OE-CCK組；4：LPS+CCK+Proglumide組；A：RT-PCR檢測CCKAR mRNA表達(dá)水平；B：Western blot檢測CCKAR蛋白表達(dá)水平；C：MTT檢測細(xì)胞活力；D：ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平；*P<0.05 **P<0.01圖4 CCK通過CCKAR減弱LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)Fig.4 CCK reduces LPS-induced cell injury and inflammation through CCKAR

2.5 CCK通過上調(diào)CCKAR激活NF-κB信號通路

Western blot結(jié)果顯示(圖5)，與空白對照組比較，加入LPS后，p-p65/p65和p-IκB/IκB表達(dá)比值均顯著升高(均P<0.01)；與LPS處理組比較，LPS+OE-CCK組p-p65/p65和p-IκB/IκB表達(dá)比值顯著降低(均P<0.01)，而在加入CCK拮抗劑后，p-p65/p65和p-IκB/IκB表達(dá)比值顯著上調(diào)(均P<0.01)。

1：空白對照組；2：LPS組；3：LPS+OE-CCK組；4：LPS+CCK+Proglumide組；**P<0.01圖5 CCK對CCKAR激活NF-κB信號通路的影響Fig.5 Effect of CCK on activation of NF-κB signaling pathway by CCKAR

3 討論

ALI指在嚴(yán)重感染、休克創(chuàng)傷以及燒傷等非心源性疾病過程中，肺泡上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，從而引起彌漫性肺間質(zhì)和肺泡水腫，導(dǎo)致呼吸衰竭。ALI發(fā)展進(jìn)程中，過度炎癥級聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的完整性破壞。新生兒ARDS病理生理過程中也存在炎癥現(xiàn)象[10]。肺上皮細(xì)胞是炎癥損傷中重要的靶細(xì)胞，內(nèi)毒素(LPS)是組成革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，是刺激ALI等嚴(yán)重炎性疾病的主要因素。因而本文利用LPS誘導(dǎo)肺上皮體外模擬ALI，也可以一定程度上模擬新生兒ARDS。

GEO數(shù)據(jù)庫收錄了世界各國研究人員提供的高通量數(shù)據(jù)，是生物信息學(xué)分析研究的重要數(shù)據(jù)提取來源，為尋求疾病發(fā)病機(jī)制以及靶點(diǎn)篩選提供了重要依據(jù)[11]。此次研究通過數(shù)據(jù)庫篩選出80個(gè)ALI樣本與正常樣本之間的差異表達(dá)基因，其中CCKAR為CCK靶點(diǎn)，在炎癥過程中同樣發(fā)揮重要作用，且有研究發(fā)現(xiàn)八肽縮膽囊素(cholecystokinin-8，CCK-8)能夠減輕LPS誘導(dǎo)大鼠ALI過程中的炎癥反應(yīng)[12]。故而將CCKAR作為此次研究的切入點(diǎn)。

與健康人群相比較，ARDS患者中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平較高[13]，而炎癥反應(yīng)可作為ALI發(fā)展過程中的驅(qū)動(dòng)因素[14]。此次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，BEAS-2B細(xì)胞中炎癥表達(dá)因子上調(diào)，且CCKAR表達(dá)下調(diào)。CCKAR是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，可通過胞外信號激活發(fā)揮抗炎作用[15]。前期研究表明，抑制CCKAR能促進(jìn)炎癥因子如TNF-α、IL-6的產(chǎn)生[16-17]。而本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CCKAR可減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。CCK家族參與抗炎和抗內(nèi)毒素休克過程[18]，在大鼠ALI研究中發(fā)現(xiàn)其能夠減輕LPS誘導(dǎo)的ALI[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCK處理后減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，且上調(diào)CCKAR表達(dá)；而CCK拮抗劑處理下調(diào)CCKAR表達(dá)并促進(jìn)炎癥反應(yīng)，表明CCK可能通過刺激CCKAR表達(dá)而降低炎癥反應(yīng)，這與之前的研究結(jié)果一致[8-19]。此外，CCK處理后，細(xì)胞中NF-κB信號通路被抑制，而在同時(shí)加入CCK拮抗劑后，NF-κB信號恢復(fù)活性。NF-κB是參與炎癥反應(yīng)的重要信號通路，有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB影響ALI中的炎癥、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)[20-21]。NF-κB信號可調(diào)節(jié)肺內(nèi)促炎因子的釋放，在各種致病因子如LPS作用下，NF-κB的過度活化促進(jìn)炎癥進(jìn)程，在ALI/ARS中發(fā)揮重要作用[22-23]。IκB是NF-κB二聚體的抑制蛋白家族，IκB通過與NF-κB結(jié)合阻止其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生活化，而磷酸化IκB可以解離NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)其活化，進(jìn)一步啟動(dòng)炎癥基因轉(zhuǎn)錄[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中，抑制IκB可以抑制NF-κB的活化進(jìn)而緩解急性肺損傷[25]。在血管上皮細(xì)胞中，CCK-8通過CCKAR和CCKBR顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化[26]。

本次研究顯示，上調(diào)CCKAR能夠抑制NF-κB信號通路的激活，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)，而CCK能夠上調(diào)CCKAR的表達(dá)。而在一些研究中也發(fā)現(xiàn)，CCKAR激活能夠抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活[27]。由此表明，CCK可能通過CCKAR抑制NF-κB信號通路的激活進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

新生兒ARDS嚴(yán)重威脅新生兒生命，多見于足月兒重癥肺炎或敗血癥等重癥感染[28-29]。ARDS同樣可發(fā)生在早產(chǎn)兒身上，且不同于我們已經(jīng)熟知的常見于早產(chǎn)兒的新生兒呼吸窘迫綜合征。嚴(yán)重肺部感染以及膿毒癥等可直接或間接引發(fā)新生兒ARDS，是威脅新生兒生命的危重疾病[30]。有研究發(fā)現(xiàn)在新生小豬ARDS模型中，抑制肺泡上皮細(xì)胞過度炎癥對保護(hù)新生小豬肺部有重要意義[31]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)CCKAR在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮作用，而抑制CCKAR可以抑制炎癥反應(yīng)。因而我們推測其在新生兒ARDS中也發(fā)揮一定作用，為后期在新生兒ALI/ARDS中的研究以及以該受體為靶點(diǎn)開發(fā)藥物提供了相關(guān)依據(jù)。