miR-519d在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對(duì)其增殖、凋亡和侵襲的影響*

杜天明， 嚴(yán) 群， 王向陽(yáng)， 王 輝△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胃腸外科，武漢 430014 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸外科，武漢 430030

結(jié)腸癌是人類癌癥死亡的主要原因之一，全世界每年新診斷病例接近60萬(wàn)例[1-2]。過(guò)去20年，結(jié)腸癌5年生存率在1970年33%的基礎(chǔ)上有所提高，但總的生存率仍低于60%[3]。深入了解結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)、提高治療效果具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在動(dòng)物、植物、真菌和病毒中進(jìn)化保守的小分子非編碼RNA。miRNAs能通過(guò)與靶基因的3′-UTR區(qū)結(jié)合而促進(jìn)mRNA降解或抑制翻譯[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可能作為抑癌基因或促癌基因影響人類癌癥的進(jìn)程[5]。miR-519d屬于19號(hào)染色體miRNA簇。研究表明miR-519d高表達(dá)于肝癌細(xì)胞[6]，低表達(dá)于卵巢癌[7]和乳腺癌[8]細(xì)胞，并且參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等惡性生物學(xué)行為。然而，miR-519d在結(jié)腸癌中的表達(dá)及功能和機(jī)制尚不清楚。本研究旨在檢測(cè)miR-519d在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異，探討該基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，并研究其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460和結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW620、LOVO、HT29均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)、STAT3及β-actin一抗均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)BD公司，miR-519d過(guò)表達(dá)序列(miR-519d mimics)及陰性對(duì)照序列(Scramble)均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成，轉(zhuǎn)染采用lipofetamineTM3000系統(tǒng)，Scramble序列：正向序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-TT-3′，反向序列5′-ACGUGACACGUUCGGAG-AATT-3′；miR-519d序列：正向序列5′-CAAAG-UGCCUCCCUUUAGAGUG-3′，反向序列5′-CU-CUAAAGGGAGGCACUUUGUU-3′。MTT試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，Trizol試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

所有細(xì)胞系均培養(yǎng)于37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的Eagle細(xì)胞培養(yǎng)液。結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期行傳代培養(yǎng)，并分成3組，即miR-519d過(guò)表達(dá)組(miR-519d組)、陰性對(duì)照組(miR-NC組)及空白對(duì)照組(Blank組)，采用lipofetamineTM3000分別轉(zhuǎn)染miR-519d mimics及Scramble，Blank組僅給予空白對(duì)照。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)

miR-519d組、miR-NC組及Blank組均采用TaqMan microRNA試劑盒提取總RNA，提取總RNA后，采用qRT-PCR測(cè)定3組細(xì)胞miR-519d的相對(duì)表達(dá)量，qPCR引物：miR-519d上游引物5′-CA-AAGTGCCTCCCTTTAGAGTG-3′，下游引物5′-AGGACGTATAAAAGATCGACCA-3′；U6小核：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用反轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，采用7500 Fast Real Time PCR System(Applied Biosystems)系統(tǒng)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，內(nèi)參為U6小核，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，測(cè)定miR-519d組、miR-NC組及Blank組3組樣品的循環(huán)閾值，計(jì)算Ct值，采用2-ΔΔCt法定量計(jì)算miR-519d組、miR-NC組及Blank組miR-519d的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖能力測(cè)定

采用MTT法測(cè)定miR-519d組、miR-NC組及Blank組3組細(xì)胞增殖能力，收集miR-519d組、miR-NC組及Blank組3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104個(gè)/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(每孔5000個(gè)細(xì)胞)，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁后第2天每孔加入5 mg/mL MTT液20 μL，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL DMSO，37℃溫箱孵育10 min或搖床低速振蕩10 min。于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值(A490nm)。

1.5 細(xì)胞凋亡能力測(cè)定

采用PI/Annexin Ⅴ-FITC雙染和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡，根據(jù)凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書中的操作方案，將miR-519d組、miR-NC組及Blank組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入膜聯(lián)蛋白A-Ⅴ-Fluos(Annexin-Ⅴ-Fluos)和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色后，上機(jī)通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定和計(jì)算3組細(xì)胞凋亡率。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

采用Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲能力，稀釋Matrigel基質(zhì)膠(稀釋比1∶5)，Transwell小室上室均勻鋪40 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)凝固。RPMI 1640培養(yǎng)液(去血清)重懸miR-519d組、miR-NC組及Blank組3組細(xì)胞，4×104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種小室上室，小室下室加入含血清培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去未穿膜細(xì)胞。多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，在200×視野下計(jì)數(shù)每組穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)

裂解變性miR-519d組、miR-NC組及Blank組細(xì)胞，采用半干法轉(zhuǎn)膜，實(shí)驗(yàn)條件：濃縮膠80 V 80 min，分離膠100 V 100 min。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)及β-actin一抗?jié)舛葹?∶300，二抗羊抗兔濃度為1∶500，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液顯影后使用膠片曝光，掃描儀導(dǎo)入膠片圖像后使用Image J軟件分析灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-519d低表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞系

qRT-PCR檢測(cè)miR-519d在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量，在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460的表達(dá)量為(1.03±0.03)，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW620、LOVO、HT29中miR-519d相對(duì)表達(dá)量分別為(0.42±0.02)、(0.28 ± 0.03)、(0.58±0.05)、(0.49 ± 0.03)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.13，P<0.01)；經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，HCT116、SW620、LOVO和HT29細(xì)胞系miR-519d相對(duì)表達(dá)量均低于NCM460(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。細(xì)胞系SW620中miR-519d的相對(duì)表達(dá)量最低，故選擇SW620行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與NCM460組比較，*P<0.05 **P<0.01圖1 miR-519d在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系及結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-519d in normal colon epithelial cell lines and colon cancer cell lines

2.2 過(guò)表達(dá)miR-519d抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染24 h后，miR-519d組miR-519d相對(duì)表達(dá)量為(21.73±0.83)，miR-NC組為(1.02±0.08)，miR-519d組miR-519d相對(duì)表達(dá)量高于miR-NC組(t=43.060，P<0.01)，Blank組與miR-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2A。MTT實(shí)驗(yàn)示細(xì)胞鋪板后0、24、48、72及96 h細(xì)胞生長(zhǎng)，結(jié)果miR-519d組對(duì)miR-NC組A490nm值分別為：(0.16±0.02)比(0.15±0.02)(t=0.612，P=0.573)，(0.23±0.02)比(0.25±0.02)(t=-1.225，P=0.288)，(0.32±0.03)比(0.41±0.04)(t=3.118，P=0.053)，(0.42±0.04)比(0.63±0.05)(t=5.681，P=0.011)及(0.57±0.05)比(1.07±0.08)(t=9.180，P=0.003)，Blank組則分別為(0.15±0.03)、(0.24±0.03)、(0.43±0.05)、(0.65±0.06)及(1.12±0.09)，與miR-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2B。

A：轉(zhuǎn)染效率測(cè)定；B：細(xì)胞增殖曲線；與miR-NC組比較，*P<0.05 **P<0.01圖2 過(guò)表達(dá)miR-519d抑制SW620細(xì)胞增殖Fig.2 Overexpression of miR-519d inhibits the proliferation of SW620 cell line

2.3 過(guò)表達(dá)miR-519d促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620細(xì)胞凋亡

利用PI/Annexin Ⅴ-FITC雙染和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡，其中miR-519d組細(xì)胞凋亡率為(23.65±1.23)%，miR-NC組為(4.96±0.63)%，Blank組為(4.78±0.73)%，miR-519d組細(xì)胞凋亡率高于miR-NC組(t=23.805，P=0.002)，miR-NC組與Blank組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.334，P=0.760)，見(jiàn)圖3。

A：流式細(xì)胞術(shù)B：細(xì)胞凋亡率；與miR-NC組比較，**P<0.01圖3 過(guò)表達(dá)miR-519d促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡Fig.3 Overexpression of miR-519d promotes the apoptosis of SW620 cell line

2.4 miR-519d過(guò)表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)示：200×視野下，miR-519d組侵襲細(xì)胞數(shù)為(55±8)個(gè)，miR-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)為(137±14)個(gè)，Blank組侵襲細(xì)胞數(shù)為(145±15)個(gè)，miR-519d組侵襲細(xì)胞數(shù)少于miR-NC組(t=8.813，P=0.003)，Blank組與miR-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.638，P=0.570)，見(jiàn)圖4。

A：Transwell實(shí)驗(yàn)(×200)；B：侵襲細(xì)胞數(shù)；與miR-NC組比較，**P<0.01圖4 過(guò)表達(dá)miR-519d促進(jìn)SW620細(xì)胞侵襲Fig.4 Overexpression of miR-519d promotes the invasion of SW620 cell line

2.5 miR-519d過(guò)表達(dá)對(duì)STAT3和XIAP蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)了miR-519d調(diào)節(jié)增殖、凋亡與侵襲相關(guān)的靶蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)miR-519d組XIAP蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.32±0.04)，miR-NC組為(1.00±0.05)，miR-519d組XIAP蛋白相對(duì)表達(dá)量低于miR-NC組(t=-18.394，P<0.01)，Blank組為(1.04±0.06)，Blank組與miR-NC組XIAP蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-519d組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.44±0.04)，miR-NC組為(1.05±0.07)，miR-519d組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于miR-NC組(t=-12.031，P<0.01)，Blank組與miR-NC組STAT3蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

與miR-NC組比較，**P<0.01圖5 過(guò)表達(dá)miR-519d對(duì)STAT3和XIAP蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of overexpression of miR-519d on STAT3 and XIAP protein expression

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有高度異質(zhì)性、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、生存率低等特點(diǎn)[9]。miR-519d已被證實(shí)能夠調(diào)控多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展。文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)熒光素酶實(shí)驗(yàn)后證實(shí)，miR-519d有多個(gè)作用靶點(diǎn)，比如：miR-519d通過(guò)靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A、第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白、絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶2促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]；通過(guò)靶向XIAP影響卵巢癌細(xì)胞增殖并干擾順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；通過(guò)靶向Smad7蛋白促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-519d在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW620、LOVO、HT29中表達(dá)均顯著低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460，提示miR-519d是一種新的結(jié)腸癌抑癌基因，可能發(fā)揮抑癌基因的功能。隨后研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-519d影響結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，包括抑制增殖、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，miR-519d顯著降低SW620細(xì)胞株STAT3和XIAP蛋白的表達(dá)水平，說(shuō)明miR-519d可能通過(guò)負(fù)調(diào)控STAT3和XIAP阻礙結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

Pang等[7]通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中XIAP是miR-519d的靶基因，miR-519d過(guò)表達(dá)顯著抑制XIAP蛋白和mRNA表達(dá)水平，且低表達(dá)XIAP可介導(dǎo)miR-519d對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。是多種惡性腫瘤的關(guān)鍵致癌因素，能通過(guò)抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成參與腫瘤的進(jìn)展[12]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3是G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1，CCND1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、抑制細(xì)胞凋亡的桿狀病毒抑制劑(Survivin)、凋亡抑制基因(B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xL)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)等的正調(diào)控因子，而這些是涉及細(xì)胞凋亡抑制或誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲的重要基因[13]。文獻(xiàn)[14]指出下調(diào)STAT3可顯著抑制MMP-2表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力，并通過(guò)抑制Bcl-xL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Xiong等[15]發(fā)現(xiàn)JAK1/STAT3信號(hào)通路受阻促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，削弱腫瘤細(xì)胞侵襲能力。越來(lái)越多的研究證實(shí)，miRNAs與STAT3信號(hào)通路密切相關(guān)，多個(gè)miRNAs如miR-124、miR-155、miR-21分別參與STAT3介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌、人喉鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[13，16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-519d表達(dá)升高后STAT3蛋白表達(dá)降低，表明miR-519d對(duì)STAT3有一定的抑制作用，是miR-519d高表達(dá)組結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲受抑制的影響因素。

XIAP是一種眾所周知的細(xì)胞凋亡阻遏物，通過(guò)與Caspase-3，7，9綁定結(jié)合抑制細(xì)胞凋亡[18]。XIAP也是細(xì)胞凋亡抑制劑家族(IAP)中最有效的成員，其表達(dá)下調(diào)被認(rèn)為是抗腫瘤的有效方法[18]。XIAP蛋白包含3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，BIR2及側(cè)翼區(qū)域負(fù)責(zé)結(jié)合并有效抑制Caspase-3，7，而BIR3和側(cè)翼區(qū)域抑制Caspase-9活性[19]。此外，XIAP也被證實(shí)參與其他多種細(xì)胞生命活動(dòng)，如調(diào)控受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程和蛋白泛素化[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡抑制因子X(jué)IAP受miR-519d負(fù)調(diào)控，表明XIAP表達(dá)降低可能是miR-519d誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的直接原因。盡管我們對(duì)miR-519d在結(jié)腸癌中的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步探索，但其具體的分子調(diào)控機(jī)制及臨床意義還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明miR-519d低表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞，miR-519d模擬物可通過(guò)下調(diào)STAT3和XIAP表達(dá)顯著抑制腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，這使得miR-519d有望成為結(jié)腸癌臨床診斷、預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物，也可能為開發(fā)新的治療手段提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。