牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)選擇性自噬接頭蛋白SQSTM1/p62高表達(dá)在食管鱗癌中的臨床意義及預(yù)后價(jià)值*

郭藝博， 劉怡文， 楊海軍， 代寧濤， 孫 蔚，米優(yōu)嘉， 張家銘， 周福有， 原 翔， 高社干△

1河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院(臨床醫(yī)學(xué)院)腫瘤醫(yī)院，河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003 2 河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，洛陽(yáng) 471003 安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院 3病理科 4胸外科，安陽(yáng) 455000

食管癌的發(fā)病率與病死率極高，90%以上食管癌為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[1]。本團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)感染可促進(jìn)ESCC的惡性進(jìn)展[2]，但其具體致病機(jī)制尚不明確。自噬作為真核細(xì)胞內(nèi)降解錯(cuò)誤折疊蛋白、清除受損細(xì)胞器及外來(lái)病原微生物的重要生物學(xué)過(guò)程，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。其中，選擇性自噬接頭蛋白sequestosome-1(SQSTM1/p62)作為自噬過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其高表達(dá)可為病原微生物在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期定植提供有利條件[4]。幽門(mén)螺旋桿菌及丙型肝炎病毒可通過(guò)激活p62，阻斷自噬流，加速胃癌和肝癌的惡性進(jìn)展[5-6]。同時(shí)，p62的高表達(dá)與乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、化療抵抗以及不良預(yù)后密切相關(guān)[7-8]。由此推測(cè)Pg可能通過(guò)誘導(dǎo)p62高表達(dá)，導(dǎo)致ESCC自噬受阻，促進(jìn)其惡性進(jìn)展。

本研究首先通過(guò)Pg感染ESCC細(xì)胞，初步分析Pg對(duì)p62的誘導(dǎo)效應(yīng)。并檢測(cè)ESCC組織中Pg感染及p62的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析該誘導(dǎo)效應(yīng)與患者臨床病理特征及生存期的相關(guān)性，為ESCC治療提供新思路和治療手段。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2011～2014年在河南省安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院行食管癌根治術(shù)的186例ESCC患者為研究對(duì)象。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理首次診斷為ESCC且未合并其他腫瘤；②術(shù)前未接受過(guò)放化療或免疫治療且腫瘤直徑>5 mm；③術(shù)后常規(guī)化療；④病例資料信息齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理非首次診斷為ESCC，或非ESCC，或合并其他腫瘤；②術(shù)前接受過(guò)放化療或免疫治療且腫瘤直徑≤5 mm；③術(shù)后未采用常規(guī)化療；④病例資料信息不全。

最終，因4例病理診斷為食管腺癌、3例術(shù)前接受過(guò)放化療而被排除，共計(jì)179位ESCC患者被納入研究。其中包括男性104例，女性75例；年齡60歲及以上100例，60歲以下79例；101例有吸煙史，78例無(wú)吸煙史；95例有飲酒史，84例無(wú)飲酒史；104例低分化，75例中-高分化；130例腫瘤侵及外膜，49例未侵及外膜；107例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，72例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；103例Ⅲ/Ⅳ，76例Ⅰ/Ⅱ。

1.2 主要試劑與儀器

人ESCC細(xì)胞系KYSE150及293T細(xì)胞系(中國(guó)博谷生物科技有限公司)；Pg菌株ATCC 33277及Pg兔抗人單克隆抗體(美國(guó)路易斯維爾大學(xué)口腔生物實(shí)驗(yàn)室捐贈(zèng))；GAM肉湯培養(yǎng)液、5%脫纖維綿羊血、1%氯化血紅素、0.1%維生素K、檸檬酸抗原修復(fù)液、DAB顯色液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光顯影液、結(jié)晶紫、EBSS(Earle’s balanced salt solution)、PBS(中國(guó)索萊寶公司)；鋨酸、醋酸鈾、檸檬酸鉛(上海默克公司)；單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC，中國(guó)索萊寶公司)，Lysotracker Red(中國(guó)索萊寶公司)；慢病毒包裝試劑盒(中國(guó)Cyagen公司)；RPMI-1640及DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；IHC試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；CCK-8試劑盒、p62和GAPDH兔抗人單克隆抗體與二抗(美國(guó)Abcam公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)；透射電子顯微鏡(英國(guó)OPTON公司)；電鏡超薄切片機(jī)(美國(guó)LEICA公司)，共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；厭氧工作站(美國(guó)COY公司)；凝膠成像系統(tǒng)及酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3 慢病毒載體敲低KYSE150細(xì)胞p62表達(dá)

293T細(xì)胞由含10%胎牛血清(56℃熱滅活30 min)的DMEM培養(yǎng)液于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待密度為60%～70%時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將待包裝的p62基因沉默shRNA質(zhì)粒(5′-GCATTGAAGTTGATATCGAT-3′)與慢病毒包裝質(zhì)?；旌虾?，與轉(zhuǎn)染試劑混合為DNA-EndoFectin混合物。將其加入293T細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)后更換為新鮮培養(yǎng)液。加入滴度增強(qiáng)劑Titer Boost，48 h后收取病毒上清，過(guò)濾去除細(xì)胞碎片。待KYSE150細(xì)胞密度至50%～60%時(shí)，加入病毒上清進(jìn)行轉(zhuǎn)染。嘌呤霉素篩選培養(yǎng)，2周后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)p62敲降效率[9]。

1.4 Western blot檢測(cè)

新鮮提取細(xì)胞蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度并定量。每泳道上樣30 μg總蛋白，在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉后，依次孵育p62抗體(1∶2000)及二抗(1∶2000)。采用ECL發(fā)光顯影液檢測(cè)目的蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行測(cè)定，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量[10]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Pg感染ESCC細(xì)胞

Pg在GAM肉湯培養(yǎng)液(含5%脫纖維綿羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K1)中，于37 ℃，85%N2、10%H2和5%CO2的厭氧工作站中常規(guī)培養(yǎng)。利用革蘭染色法及哥倫比亞血瓊脂板檢測(cè)Pg的純度。選取活力較好的Pg菌液(A600nm=1～2)，待細(xì)胞密度為60%～70%時(shí)，以MOI=10的比例將Pg加入細(xì)胞培養(yǎng)液，作用不同時(shí)間[10]。

1.6 透射電子顯微鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

收集感染及未感染Pg的KYSE150細(xì)胞，經(jīng)2.5%戊二醛固定2 h，將其包裹在2.5%瓊脂中制成1 mm3的小塊，再置于鋨酸中固定。隨后分別于50%、70%、90%、95%和100%乙醇中梯度脫水，每次10 min。收集脫水后的細(xì)胞樣品于樹(shù)脂及丙酮混合液中滲透，將樣品包埋，經(jīng)超薄切片機(jī)制片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色后于透射電子顯微鏡下拍攝[11]。

1.7 共聚焦顯微鏡拍攝

將各組細(xì)胞接種于共聚焦皿(1000個(gè)/皿)常規(guī)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞換液后加入MDC自噬體特異性染料及Lysotracker Red溶酶體特異性染料，于37℃孵育1 h。在共聚焦顯微鏡下拍攝并定量分析MDC及Lysotracker Red的共定位情況[12]。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%，用無(wú)菌槍頭在培養(yǎng)孔內(nèi)劃線并記錄位置，PBS洗滌后常規(guī)培養(yǎng)。每3小時(shí)對(duì)每孔同一位置拍照記錄。應(yīng)用Image J軟件測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)各組劃痕內(nèi)空白區(qū)域大小，并計(jì)算遷移面積[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 平板克隆實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞以1000個(gè)/孔接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，每3天換液1次。于第15天固定細(xì)胞，用1%結(jié)晶紫染色后拍照留存，并記錄各組細(xì)胞克隆形成數(shù)[14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞以1000或1500個(gè)/孔置于96孔板(每孔100 μL)中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK-8試劑10 μL，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，最后以酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度值[15]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色及結(jié)果判讀

每例患者取2張常規(guī)石蠟包埋的ESCC組織連續(xù)切片(片厚2.5 μm)，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、過(guò)氧化物酶阻斷劑及山羊血清封閉后，分別加入Pg(1∶1000)及p62抗體(1∶200)孵育；PBS清洗后經(jīng)山羊抗鼠/兔聚合物孵育、SP封閉、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水，二甲苯透明后以中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判讀：連續(xù)切片中癌細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為Pg感染或p62表達(dá)陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照本課題組前期研究[16]，Pg感染陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為：≤3分定義為陰性，>3分且≤12分定義為陽(yáng)性；p62陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為：≤3分定義為陰性，>3分且≤12分定義為陽(yáng)性[17]。每例2張連續(xù)切片中Pg及p62同時(shí)判定為陽(yáng)性的組織樣本定義為Pg誘導(dǎo)p62高表達(dá)陽(yáng)性，作為Pg+p62陽(yáng)性組；不滿足2張連續(xù)切片同時(shí)陽(yáng)性的歸為陰性組，以Pg+p62陰性組表示。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Pg可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中自噬體累積及p62高表達(dá)

為檢測(cè)Pg感染對(duì)ESCC細(xì)胞自噬水平的影響，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察Pg感染后KYSE150細(xì)胞中自噬體數(shù)量，結(jié)果(圖1A)顯示：與對(duì)照組相比，Pg感染后KYSE150細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量顯著增多(P<0.05)，提示Pg感染后可引起KYSE150細(xì)胞發(fā)生自噬。隨后通過(guò)Western blot檢測(cè)Pg感染KYSE150細(xì)胞不同時(shí)間(6、9、12、24 h)對(duì)各組細(xì)胞中p62、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果(圖1B、1C)顯示：Pg感染組p62蛋白表達(dá)量顯著高于Pg未感染組(P<0.05)，且感染組中p62表達(dá)量隨Pg感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高，24 h增高最為顯著，提示Pg感染可誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞中p62高表達(dá)；與對(duì)照組相比，Pg感染組中Beclin1蛋白表達(dá)量隨Pg感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減少，而LC3表達(dá)量隨Pg感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多，提示Pg感染可誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞中Beclin1低表達(dá)、LC3高表達(dá)，見(jiàn)圖1D、1E。

Pg-：未感染Pg的對(duì)照組KYSE150細(xì)胞；Pg+：感染Pg的KYSE150細(xì)胞；A：透射電鏡觀察Pg感染后KYSE150細(xì)胞中自噬體數(shù)量；B：Western blot法檢測(cè)Pg對(duì)KYSE150細(xì)胞中自噬蛋白p62、Beclin1、LC3表達(dá)量的影響；C，D，E：?jiǎn)我蛩胤讲罘治霰容^各組細(xì)胞中p62、Beclin1、LC3蛋白的表達(dá)差異；與Pg未感染組比較，* P<0.05圖1 Pg可誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞中自噬體累積及p62高表達(dá)Fig.1 Pg can induce accumulation of autophagosome and high expression of p62 in KYSE150 cells

2.2 Pg通過(guò)誘導(dǎo)p62高表達(dá)引起ESCC細(xì)胞自噬進(jìn)程受阻

對(duì)KYSE150細(xì)胞分別進(jìn)行EBSS饑餓、Pg感染及敲低p62表達(dá)處理，經(jīng)MDC及Lysotracker Red共染后于共聚焦顯微鏡下拍攝。實(shí)驗(yàn)分為7組：①對(duì)照KYSE150細(xì)胞(對(duì)照組)，②EBSS饑餓組，③Pg感染6 h組，④Pg感染24 h組，⑤p62敲低+EBSS饑餓組，⑥p62敲低+Pg感染6 h組，⑦p62敲低+Pg感染24 h組。共聚焦顯微鏡下檢測(cè)各組細(xì)胞中MDC與Lysotracker Red的共定位情況，結(jié)果(圖2A、2B)顯示：與對(duì)照組相比，Pg感染6 h組MDC與Lysotracker Red共定位量顯著升高(P<0.05)，提示在Pg感染初期能夠誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞發(fā)生自噬，與EBSS饑餓誘導(dǎo)自噬的結(jié)果類(lèi)似；與Pg感染6 h組相比，Pg感染24 h組MDC與Lysotracker Red共定位量顯著減弱(P<0.05)，提示Pg持續(xù)感染可能使自噬受阻；在p62敲降的KYSE150細(xì)胞中，與EBSS饑餓組比較，p62敲低+EBSS饑餓組中MDC與Lysotracker Red共定位量明顯減弱(P<0.05)，提示p62敲除后KYSE150細(xì)胞自噬減弱；敲低p62表達(dá)后，無(wú)論P(yáng)g感染時(shí)間長(zhǎng)短，均無(wú)法誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞自噬增強(qiáng)(P>0.05)，提示Pg感染后KYSE150細(xì)胞自噬水平的變化與p62密切相關(guān)。

①：對(duì)照組KYSE150細(xì)胞；②：EBSS饑餓組；③Pg感染6 h組；④Pg感染24 h組；⑤p62敲低+EBSS饑餓組；⑥p62敲低+Pg感染6 h組；⑦p62敲低+Pg感染24 h組；A：共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞MDC與Lysotracker Red的共定位情況；B：?jiǎn)我蛩胤讲罘治霰容^各組細(xì)胞中MDC與Lysotracker Red的共定位量；與①組比較，1)P<0.05；與②組比較，2)P<0.05；與③組比較，3)P<0.05圖2 Pg通過(guò)誘導(dǎo)p62高表達(dá)引起KYSE150細(xì)胞自噬進(jìn)程受阻Fig.2 Pg causes autophagy inhibition in KYSE150 cells by inducing high expression of p62

2.3 Pg通過(guò)誘導(dǎo)p62高表達(dá)增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖及遷移能力

對(duì)KYSE150細(xì)胞進(jìn)行Pg感染及敲低p62表達(dá)處理，實(shí)驗(yàn)分為4組：①對(duì)照KYSE150細(xì)胞(對(duì)照組)，②Pg感染組(感染24 h)，③p62敲低組，④p62敲低+Pg感染組。檢測(cè)各組細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)量，結(jié)果(圖3A、3B)顯示：與對(duì)照組相比，p62敲低組中p62蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而Pg感染24 h組中p62蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，提示Pg可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中p62高表達(dá)，與2.1中結(jié)果一致。平板克隆(圖3C、3D)、CCK-8(圖3E、3F)及劃痕實(shí)驗(yàn)(圖3G、3H)結(jié)果顯示：與對(duì)照組及Pg感染組相比，p62敲低組及p62敲低+Pg感染組中細(xì)胞的增殖及遷移能力顯著減弱(均P<0.05)，提示p62蛋白的敲降抑制了ESCC細(xì)胞的增殖及遷移能力；與對(duì)照組相比，Pg感染24 h組中細(xì)胞的增殖及遷移能力顯著增強(qiáng)(均P<0.05)，提示Pg感染可增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖及遷移能力；與p62敲低+Pg感染組相比，Pg感染組中細(xì)胞的增殖及遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而p62敲低組中細(xì)胞的增殖及遷移能力無(wú)明顯差異(P>0.05)，提示Pg可通過(guò)誘導(dǎo)p62高表達(dá)增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖及遷移能力。

①：對(duì)照KYSE150細(xì)胞(對(duì)照組)；②Pg感染組；③p62敲低組；④p62敲低+Pg感染組；A，B：Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)分析；C，D：平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力；E，F(xiàn)：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力；G，H：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力；與①組比較，1)P<0.05；與②組比較，2)P<0.05圖3 Pg誘導(dǎo)p62高表達(dá)增強(qiáng)KYSE150細(xì)胞的增殖及遷移能力Fig.3 Pg enhances the proliferation and migration ability of KYSE150 cells by inducing high expression of p62

2.4 Pg感染與ESCC組織中p62高表達(dá)相關(guān)

對(duì)179例ESCC患者的食管癌及相應(yīng)癌旁組織進(jìn)行石蠟包埋、連續(xù)切片，采用IHC檢測(cè)。結(jié)果(圖4)顯示：ESCC組織中可見(jiàn)癌細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，為Pg感染陽(yáng)性，而癌旁組織中Pg染色多為陰性，Pg陽(yáng)性率明顯低于ESCC組織(P<0.05，表1)；p62主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，為棕黃色或棕褐色顆粒，且癌旁組織p62的表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于ESCC組織(P<0.05，表2)；同時(shí)，ESCC組織中Pg感染與p62高表達(dá)具有顯著一致性(P<0.01，表3)。

圖4 IHC檢測(cè)ESCC與癌旁組織中Pg感染與p62表達(dá)情況(×400)Fig.4 Detection of Pg infection and p62 expression in ESCC tissues and adjacent normal tissues by IHC(×400)

表1 ESCC患者食管癌及癌旁組織中Pg陽(yáng)性率比較[例(%)]Table 1 Comparison of the positive rate of Pg infection between cancer tissues and adjacent normal tissues from ESCC patients[n(%)]

表2 ESCC患者食管癌及癌旁組織中p62表達(dá)情況比較[例(%)]Table 2 Comparison of the positive rate of p62 expression between cancer tissues and adjacent normal tissues from ESCC patients[n(%)]

表3 ESCC組織中Pg感染與p62表達(dá)的一致性分析[例(%)]Table 3 Consistency analysis between Pg infection and p62 expression in ESCC tissues[n(%)]

2.5 Pg感染及p62表達(dá)與ESCC患者生存期相關(guān)性

結(jié)果見(jiàn)圖5及表4。179例ESCC患者術(shù)后5年生存率及中位生存時(shí)間分別為26.26%和(28.00±2.22)月。其中Pg感染陽(yáng)性患者5年生存率為16.25%，中位生存時(shí)間為(20.00±1.12)月，顯著低于陰性患者的5年生存率(34.34%)及中位生存時(shí)間[(34.00±2.49)月](均P<0.05)；p62表達(dá)陽(yáng)性患者5年生存率為20.00%，中位生存時(shí)間為(21.00±2.31)月，顯著低于p62表達(dá)陰性患者(均P<0.05)；Pg感染與p62表達(dá)共陽(yáng)性患者(Pg+p62陽(yáng)性組)5年生存率為15.38%，中位生存時(shí)間為(19.00±1.10)月，顯著低于非共陽(yáng)性患者(Pg+p62陰性組，均P<0.05)。此外，與Pg感染陽(yáng)性或p62表達(dá)陽(yáng)性的患者比較，二者共陽(yáng)性的患者(Pg+p62陽(yáng)性組)5年生存率降低最為顯著。

A：ESCC患者術(shù)后5年生存曲線；B：Pg感染陽(yáng)性與陰性患者術(shù)后5年生存曲線；C：p62表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者術(shù)后5年生存曲線；D：Pg+p62陽(yáng)性組與陰性組患者術(shù)后5年生存曲線圖5 ESCC患者術(shù)后5年Kaplan-Meier生存曲線Fig.5 5-year Kaplan-Meier survival curve of ESCC patients after surgery

表4 不同組ESCC患者的生存時(shí)間(月)Table 4 Survival time of ESCC patients in each group(month)

2.6 Pg感染及p62表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征相關(guān)性

按表3中Pg感染與p62表達(dá)情況對(duì)179例ESCC患者進(jìn)行分組，分析Pg感染與p62表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示(表5)，Pg感染、p62陽(yáng)性表達(dá)及Pg+p62表達(dá)共陽(yáng)性均與患者性別、吸煙、飲酒、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(表5，均P<0.05)。

表5 Pg感染及p62表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的相關(guān)性[例(%)]Table 5 Correlation between Pg infection，p62 expression and clinicopathological features of ESCC patients[n(%)]

3 討論

ESCC是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，具有顯著的地域性[18]，早期無(wú)明顯癥狀，臨床上大多確診即為中晚期，且5年生存率極低[19]。因此，探明ESCC的病因，尋找早期診斷指標(biāo)與有效預(yù)防措施尤為重要。

資料顯示，病原微生物感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]，Pg作為一種條件致病菌，廣泛定植于口腔和消化道內(nèi)，其慢性感染及長(zhǎng)期定植可促進(jìn)食管癌[21]、肺癌[22]及結(jié)腸癌[23]等多種腫瘤的惡性進(jìn)展。我們前期研究已證實(shí)，Pg在上消化道腫瘤中呈上高下低的分布狀態(tài)，且可長(zhǎng)期定植于ESCC細(xì)胞[16]，同時(shí)Pg感染陽(yáng)性的患者生存期顯著縮短[24]。本研究結(jié)果與之一致，提示Pg感染促進(jìn)了ESCC的惡性進(jìn)展。

自噬是細(xì)胞內(nèi)降解受損細(xì)胞質(zhì)組分以維持其穩(wěn)態(tài)的一種重要生理活動(dòng)。資料顯示，病原微生物入侵時(shí)，宿主細(xì)胞將其包裹入自噬體，運(yùn)輸至溶酶體進(jìn)行清除[25]，隨著病原微生物的長(zhǎng)期感染，為逃避自噬的清除作用，病原微生物演進(jìn)出多種抑制自噬體形成與成熟的機(jī)制。SARS-CoV-2病毒可通過(guò)抑制SNAP29與syntaxin17的相互作用而阻斷自噬體與溶酶體融合[26]，而柯薩奇病毒可通過(guò)調(diào)控自噬蛋白plekhm1而阻礙自噬體向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。研究顯示，Pg同樣可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[28-29]，且隨著Pg的持續(xù)感染，可通過(guò)干擾自噬體與溶酶體融合的過(guò)程，為自身長(zhǎng)期定植提供有利條件[30]。p62為自噬過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)水平的高低與自噬流的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?？袢《究赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)p62高表達(dá)，抑制自噬體成熟，導(dǎo)致自噬體大量堆積，并利用自噬體中待降解的蛋白為自身供能，從而長(zhǎng)期定植，且病毒載量與p62表達(dá)水平呈正相關(guān)[31]；結(jié)核分枝桿菌可通過(guò)誘導(dǎo)p62的組蛋白超甲基化，引起自噬流受阻，促進(jìn)細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生存[32]。此外，p62表達(dá)水平的高低還與多種腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[33]。p62高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者生存期顯著縮短[34]，且p62缺失的食管癌患者化療敏感性顯著增強(qiáng)[35]，p62已成為多種腫瘤的重要標(biāo)志蛋白及關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Pg感染初期可通過(guò)p62介導(dǎo)ESCC細(xì)胞發(fā)生自噬，而隨著Pg持續(xù)感染，可進(jìn)一步通過(guò)誘導(dǎo)p62高表達(dá)導(dǎo)致ESCC細(xì)胞自噬進(jìn)程受阻，為自身于ESCC細(xì)胞中長(zhǎng)期定植提供有利條件并增強(qiáng)ESCC細(xì)胞增殖及遷移能力，同時(shí)在ESCC組織中二者表達(dá)具有顯著一致性。對(duì)179例ESCC患者術(shù)后5年生存分析發(fā)現(xiàn)Pg感染及p62表達(dá)陽(yáng)性的患者5年生存率及中位生存時(shí)間均顯著低于陰性患者，其中二者共陽(yáng)性的患者(Pg+p62陽(yáng)性組)5年生存期縮短最為顯著，提示Pg感染及p62高表達(dá)均可影響ESCC患者生存期，且二者共陽(yáng)性對(duì)患者生存期影響最大。通過(guò)χ2檢驗(yàn)分析Pg+p62陽(yáng)性組患者與其臨床病理特征相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Pg+p62陽(yáng)性組患者多為吸煙、飲酒的男性，提示長(zhǎng)期吸煙、飲酒的男性患者感染Pg的風(fēng)險(xiǎn)增高，并伴隨分化程度低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期晚，此時(shí)Pg對(duì)p62的誘導(dǎo)效應(yīng)逐漸加強(qiáng)，提示該誘導(dǎo)效應(yīng)與ESCC的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。

綜上所述，Pg可通過(guò)誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞p62高表達(dá)，干擾其自噬進(jìn)程，為自身長(zhǎng)期定植提供有利條件，促進(jìn)ESCC惡性進(jìn)展。由于病原微生物感染與腫瘤細(xì)胞自噬及惡性進(jìn)展是一個(gè)相互交織、涉及多因素的復(fù)雜過(guò)程，因此Pg與自噬相關(guān)的致病機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索，也有待相關(guān)的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。但打破Pg在ESCC細(xì)胞內(nèi)持久定植的現(xiàn)狀，并有效控制p62表達(dá)，對(duì)于ESCC臨床防治策略的制定及有效延緩ESCC惡性進(jìn)展，延長(zhǎng)患者生存期而言具有重要的科學(xué)理論意義。