谷氨酸脫羧酶基因的挖掘、表征及全細胞制備γ-氨基丁酸的研究

馮 驍， 池慧兵， 孟凡強， 陸兆新， 朱 萍， 呂鳳霞

（南京農業(yè)大學 食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種天然存在的氨基酸，廣泛分布在原核與真核生物中。在哺乳動物的神經系統(tǒng)中，GABA為抑制性神經遞質[1]，在神經活動中扮演重要的角色。國內外研究表明，GABA具有調節(jié)神經傳導，增強記憶力，調節(jié)血壓心率，促進生長激素分泌，調節(jié)腸道微生物區(qū)系等多種作用[2-6]。GABA已被添加至許多食品及其加工原料中，包括綠茶、小麥、酒曲[7-9]等，具有一定的保健功能。

GABA的制備方法主要有化學直接合成法[10]、植物富集提取法[11]、生物酶法[12]?；瘜W直接合成法在制備過程中會產生吡咯烷酮、丁內酯、γ-氯丁氰等不安全副產物，且反應條件苛刻；而植物富集提取法存在富集效率低等缺陷。相比之下，生物酶法具有安全性好、生產效率高與生產成本低等優(yōu)勢，為目前較為理想的GABA制備方法。研究學者在動物、植物、微生物中均發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）。但由于動植物來源的GAD分離純化較為困難，因此，微生物來源的GAD研究較為廣泛，主要包括短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）等[13-16]，然而這些來源的GAD存在熱穩(wěn)定性差、pH穩(wěn)定性范圍較窄、與底物的親和力不高，以及后期產物的分離純化工藝煩瑣、耗能大、收益低等缺點，難以滿足工業(yè)應用需求。如大腸桿菌GAD在50℃孵育2 h殘余酶活力僅剩40%；屎腸球菌GAD僅在pH 5.0～5.2的窄范圍內較穩(wěn)定[17]；短乳桿菌Lb85GAD的底物親和力為22.9 mmol/L等[18-19]。因此，挖掘性能優(yōu)良的GAD基因，構建高效轉化平臺對于工業(yè)化生產GABA具有重要意義。

作者將釀酒酵母S288C來源的GAD基因進行克隆，實現(xiàn)釀酒酵母谷氨酸脫羧酶在大腸桿菌中高效表達，并對重組GAD進行分離純化及其酶學性質表征，以及全細胞制備GABA的最適條件探究，為GABA的高效生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒菌株E.coli BL21（DE3）由南京農業(yè)大學酶工程實驗室保藏；釀酒酵母谷氨酸脫羧酶（Saccharomyces cerevisiae glutamate decarboxylase）基因（GenBank NO.：GFP66652.1）由金斯瑞公司合成并克隆至質粒pET-21a（+）中，酶切位點Nde I、Xho I。

1.1.2 主要試劑磷酸吡哆醛（PLP）、GABA標準品（質量分數(shù)≥99%）、丹磺酰氯：美國Sigma公司產品；四氫呋喃（色譜級）：永華化學股份有限公司產品；甲醇（色譜級）：國藥集團化學試劑有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：在100 mL LB培養(yǎng)基中加入1.8～2.5 g的瓊脂糖。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母GAD的轉化鑒定將重組質粒pET-21a（+）-GAD轉入表達宿主E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)10～12 h，待單菌落長出后于LB液體培養(yǎng)基中挑入單菌落并培養(yǎng)10～12 h，保存至甘油管中（甘油終體積分數(shù)為15%），并收集菌體進行測序，以確定轉化宿主成功。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵從甘油管中以體積分數(shù)為1%的接種量接種入LB液體培養(yǎng)基中（含100 μg/mL氨芐青霉素），37℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h。以體積分數(shù)為1%接種量轉接至新的LB培養(yǎng)基中，在菌體生長至對數(shù)期時（OD600為0.6～0.8）加入IPTG（終質量濃度100 μg/mL），16℃、180 r/min繼續(xù)誘導培養(yǎng)18 h。發(fā)酵完畢后8 000 r/min離心5 min，收集菌體，每100 mL發(fā)酵液用10 mL破碎緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl，pH 7.0）重懸菌體，200 W超聲破碎處理10 min。破碎液在4℃下12 000 r/min離心30 min去除細胞碎片，收集上清液。

1.2.3 ScGAD酶活力測定總反應體系為500 μL，其中490 μL為底物緩沖液（0.2 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.04 mmol/L PLP、100 mmol/L L-谷氨酸），10 μL為酶液。在60℃反應5 min，沸水浴5 min終止反應。采用高效液相色譜法測定反應生成的GABA的含量。在測定條件下每分鐘生成1 μmol GABA所需的酶定義為1個酶活力單位（U）。

1.2.4 ScGAD的純化及蛋白質質量檢測表達載體含有組氨酸標簽，使用Ni2+親和層析法進行純化。加入8 mL平衡緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、5 mmol/L咪唑，pH 7.0）進行平衡，將粗酶液加載入鎳離子親和層析柱，反復上樣2次，加入8 mL清洗緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑，pH 7.0）清洗層析柱2次，以去除雜蛋白質；加入8 mL洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH 7.0）洗柱1次，收集洗脫液。采用SDS-PAGE（5 g/dL聚丙烯酰胺濃縮膠、12 g/dL分離膠）檢測ScGAD的純度，蛋白質質量采用Bradford法測定[20]，牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白質。

1.2.5 ScGAD酶學性質測定

1）最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性 將反應體系先在不同溫度（20～70℃）中預熱。后加入10 μL酶液（蛋白質質量濃度0.2 mg/mL）反應5 min，迅速置于沸水浴中5 min終止反應，以最大酶活力為100%。將GAD在不同溫度（30～60℃）水浴不同時間（0.5～6.0 h），在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h進行取樣測定酶活力。以0 h時的酶活力為100%，測定ScGAD在不同溫度下的殘余酶活力。

2）最適反應pH及pH穩(wěn)定性 以最大酶活力為100%，在pH 2.4～7.0的緩沖液中分別加入酶液測定酶活力。將GAD酶液在不同pH緩沖液中（3.0～10.0），4℃條件下孵育12 h，調節(jié)pH至最適條件下測定酶活力，以孵育0 h處理的酶活力為100%，分別計算ScGAD在不同pH孵育后的殘余酶活力。

3）金屬離子對酶活力影響 在反應體系中分別加入終濃度5 mmol/L的金屬離子Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+測定酶活力，以不添加金屬離子（對照組）的酶活力作為100%。

4）酶的動力學參數(shù)測定 在最適條件下，配置不同底物濃度（2～20 mmol/L）的緩沖體系，分別加入10 μL酶液反應5 min，測定不同底物濃度下的酶活力，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，計算酶的Km和Vmax。

1.2.6 全細胞制備GABA的最適條件菌懸液制備：用分光光度計測定發(fā)酵液在600 nm處的吸光度以確定菌體渾濁程度，并控制在吸光度為5.0后終止發(fā)酵。取10%（體積分數(shù)）發(fā)酵液單獨離心烘干后稱質量以計算菌體質量，剩余發(fā)酵液離心后，加入10%發(fā)酵液體積的生理鹽水將菌體重懸，用于GABA制備及測定?？偡磻w系為30 mL，其中全細胞添加量為3 mL菌懸液（含酶量為每克底物100 U，菌體干質量0.13 g）。GABA生成效率計算方法如下式（1）：

式 中：y1為GABA生 成 效 率，g/（g·h）；m1為 生 成GABA的 質 量，g；m2為 菌 體 干 質 量，g；t為 反 應 時間，h。

1）PLP濃度對全細胞制備GABA的影響 在添加100 mmol/L底物條件下，反應體系中分別加入不同濃度（0～0.10 mmol/L）的PLP反應0.5 h，以不添加PLP的處理為對照組，測定不同PLP濃度對全細胞制備GABA的影響。

2）底物濃度對全細胞制備GABA的影響 在添加0.06 mmol/L PLP條件下，反應體系中加入不同濃度（50～200 mmol/L）底物進行反應，測定不同底物濃度下全細胞制備GABA的效率。

3）pH對全細胞制備GABA的影響 在添加0.06 mmol/L PLP、100 mmol/L底物條件下，反應體系使用 不 同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）緩 沖液進行反應，測定不同pH下全細胞制備GABA的效率。

4）溫度對全細胞制備GABA的影響 在最適反應體系與最適pH條件下，將反應體系在不同溫度（35～65℃）下預熱后反應，測定不同溫度下全細胞制備GABA的效率。

5）全細胞制備GABA的轉化率 在確定最優(yōu)條件后，將反應體系在0.5～3.0 h內進行反應，測定GABA的轉化率，計算方法如下式（2）：

式中：y2為GABA的轉化率；M1為生成GABA的濃度；M2為底物濃度。

1.2.7 GABA含量的測定GABA含量的測定使用改進的高效液相色譜法柱前衍生法[21-23]，液相柱：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm）使用丹黃酰氯（1-二甲氨基-萘-5-磺酰氯，DNS-CL）作為衍生劑。衍生體系400 μL，其中待測樣品20 μL，碳酸氫鈉緩沖液0.1 mol/L（pH 9.8）180 μL，丹磺酰氯-丙酮溶液（4 g/L）200 μL，于37℃下避光反應1 h。流動相：A甲醇，B四氫呋喃-甲醇-50 mmol/L乙酸鈉（pH 6.2，體積比5∶75∶420）；流量：1 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：25℃；檢測時間：30 min；紫外檢測波長：254 nm。

GABA標準曲線如圖1所示，線性回歸方程為y=8.106 7x-3.030 4，x為GABA濃度，y為信號峰面積，相關系數(shù)R2=0.992 8，大于0.990 0，表明自變量與因變量之間的線性關系良好，可用作標準曲線。

圖1 GABA標準曲線Fig.1 GABA standard curve

2 結果與分析

2.1 ScGAD的純化及SDS-PAGE分析

根據(jù)釀酒酵母全基因組序列進行GAD基因克隆，編碼基因長度為1 755 bp，無內含子，總計585個氨基酸，蛋白質理論相對分子質量約為65 000。進一步構建重組表達載體pET-21a（+）-GAD，并在E.coli BL21（DE3）中異源表達，其酶活力為2.06 U/mL。通過Ni2+親和層析純化單一電泳條帶（見圖2），與預測GAD相對分子質量大小一致。純化結果如表1所示。經親和純化后，純酶的回收率為65.3%，提高倍數(shù)為13.80倍，比活力為66.55 U/mg。

表1 ScGAD的分離純化Table 1 Separation and purification of ScGAD

圖2 pET-21a（+）-ScGAD純化產物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of pET-21a（+）-ScGAD purified product

2.2 ScGAD的酶學性質研究

2.2.1 ScGAD的最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性不同溫度下檢測酶活力發(fā)現(xiàn)（見圖3），ScGAD的最適反應溫度為60℃。在20～60℃時，隨著溫度升高，酶活力逐漸升高；當溫度超過60℃后，酶活力急劇下降。進一步對酶的溫度穩(wěn)定性進行分析發(fā)現(xiàn)，ScGAD在30～50℃條件下，5.0 h內仍具有約80%殘余酶活力；而60℃條件下，酶活力下降較快，6.0 h孵育反應后，僅有20%的殘余酶活力。以上研究結果表明，ScGAD具有優(yōu)越的溫度穩(wěn)定性，對工業(yè)加工的應用前景良好。

圖3 ScGAD的最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.3 Optimal temperature and thermostabiligy of ScGAD

2.2.2 ScGAD的最適pH及pH穩(wěn)定性通過測定不同pH下的相對酶活力發(fā)現(xiàn)，ScGAD的最適反應pH為4.0（見圖4）。在pH 2.4～4.0時，酶活力隨著pH的升高逐漸升高；在pH 4.0～5.6時酶活力隨著pH的升高緩慢下降。當pH接近中性時，相對酶活力從50%急劇下降至無活性。該酶的最適pH與其他來源的谷氨酸脫羧酶的最適pH基本一致[24-25]，原因是微生物來源的GAD在酸性范圍內具有活性，酶促反應過程需要消耗溶液中的H+以催化底物脫羧生成GABA，當溶液接近中性時，反應體系中H+變少，無法完成底物催化，而過低的pH環(huán)境會引起酶變性失去酶活[26]。pH穩(wěn)定性研究結果表明，GAD在pH 4.0～9.0具有良好的穩(wěn)定性，經12 h孵育反應，仍能保持70%以上殘余酶活力，其中pH為5.0時，ScGAD的酶活性最穩(wěn)定。

圖4 ScGAD的最適反應pH及pH穩(wěn)定性Fig.4 Optimal pH,pH stability of ScGAD

2.2.3 金屬離子對ScGAD的影響通過測定金屬離子對ScGAD的影響發(fā)現(xiàn)（見表2），Mg2+、Fe2+、Cu2+會抑制該酶10%～15%的酶活力，而其他金屬離子對酶活力的影響較小，幾乎沒有促進或抑制作用。因此，后續(xù)GAD的工業(yè)應用中不需要額外添加金屬離子，可節(jié)約生產成本。

表2 金屬離子對ScGAD相對酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions on the relative activity of ScGAD

2.2.4 ScGAD的動力學參數(shù)研究進一步對ScGAD進行酶促動力學分析，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，計算重組酶對底物L-谷氨酸的Km和Vmax，結果如圖5所示，米氏常數(shù)Km為14.28 mmol/L，最大反應速度Vmax為0.59 mmol/（L·min）。

圖5 ScGAD動力學參數(shù)測定曲線Fig.5 Kinetic parameters of ScGAD

2.3 全細胞制備GABA的最適條件探究

2.3.1 PLP濃度對全細胞制備GABA的影響PLP作為輔酶可與底物L-谷氨酸結合形成Schiff堿結構，該結構可以降低谷氨酸脫羧反應的活化能，從而提高酶促反應速率[27]。通過考察PLP對GAD催化反應的影響發(fā)現(xiàn)，添加0.10 mmol/L PLP對GABA生成效率提升最高，是無添加PLP對照組的8倍，可以達到16.7 g/（g·h）（見圖6）。而PLP添加濃度在0.06～0.10 mmol/L時，GABA的生成效率變化不大，綜合考慮PLP添加成本，最終選取PLP濃度為0.06mmol/L添加至全細胞反應體系。

圖6 PLP濃度對全細胞制備GABA的影響Fig.6 Effects of PLP concentration on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.2 底物濃度對全細胞制備GABA的影響GABA制備過程中底物濃度變化可能會影響細胞膜兩側的滲透壓，進而影響GABA生成效率，因此需要考察不同底物濃度對GABA制備過程的影響。如圖7所示，當濃度小于100 mmol/L，隨著底物濃度的增大，產物的生成效率逐漸提高，且在濃度為100 mmol/L，達到最大生成效率22.2 g/（g·h）。而濃度超過100 mmol/L，GABA生成效率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，這可能是ScGAD的催化反應存在底物抑制或過高的環(huán)境滲透壓抑制底物轉運的原因，因此反應體系中過高的底物濃度會影響細胞對于底物的轉運[28]。

圖7 底物濃度對全細胞制備GABA的影響Fig.7 Effects of substrate concentration on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.3 pH對全細胞制備GABA的影響ScGAD是一種酸性酶，因此考察pH對GAD制備GABA的影響十分必要。如圖8所示，在pH 3.0～5.5時，GABA生成效率均較高，其中pH為4.0時生成效率最高，達到28.8 g/（g·h）。這說明GAD可在寬泛pH范圍內制備GABA，滿足工業(yè)應用中復雜多變的pH條件。

圖8 pH對全細胞制備GABA的影響Fig.8 Effects of pH on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.4 溫度對全細胞制備GABA的影響溫度是影響GABA制備的重要因素之一，通過研究溫度對ScGAD全細胞制備GABA的影響發(fā)現(xiàn)，在35～50℃下，GABA生成效率均較低，最高僅能達到6.5 g/（g·h），而催化溫度在55～65℃時，GABA生成效率均較高，且在60℃下產物的生成效率最高達到35.9 g/（g·h）（見圖9）。因此60℃為GAD的最適反應溫度，反應溫度低于60℃，GAD相對酶活力低導致催化效率低，而反應溫度高于60℃，重組酶的穩(wěn)定性受到影響。以上研究結果證明重組酶可在高溫下高效合成GABA。

圖9 溫度對全細胞制備GABA的影響Fig.9 Effects of temperature on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.5 全細胞制備GABA的轉化率在確定最優(yōu)條件后，通過研究反應時間對ScGAD全細胞制備GABA的轉化率發(fā)現(xiàn)，在0.5～2.5 h時，隨著反應時間的增加，GABA轉化率逐漸提高，但提高幅度逐漸變慢，可能原因是酶在60℃時穩(wěn)定性隨著時間的延長逐漸下降，當反應時間達到2.5 h時，GABA的轉化率達到99%，產量為10.3 g/L，并隨著反應時間的延長不再變化（見圖10）。以上研究結果說明重組酶可在較短的時間內高效合成GABA。

圖10 反應時間對全細胞制備GABA的影響Fig.10 Effects of reaction time on the preparation of GABA in whole cells by ScGAD

3 討論

近年來，谷氨酸脫羧酶因其可應用于功能性物質GABA生產已成為研究熱點之一。雖然研究學者們已從多種微生物中挖掘并表征了谷氨酸脫羧酶酶學性質，但這些來源的GAD難以滿足工業(yè)應用需求。目前有關釀酒酵母谷氨酸脫羧酶研究較少[29]，作者通過對釀酒酵母谷氨酸脫羧酶基因進行挖掘，發(fā)現(xiàn)該酶的比活力高達66.55 U/mg，顯著高于一些微生物來源的GAD的比活力，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，比活力37.60 U/mg）[30]，以及短乳桿菌Lb85（Lactobacillus brevis，比活力38.46 U/mg）[31]等。

酶學性質研究表明，ScGAD的熱穩(wěn)定較好，在50℃下孵育2 h的殘余酶活力高于大腸桿菌谷氨酸脫羧酶在50℃下的殘余酶活力（60%）[18]，且在30～50℃下孵育5.0 h后殘余酶活力仍約為80%。ScGAD的最適反應pH為4.0，這與大部分其他來源的GAD的最適pH為弱酸性相一致[24-25，32]。值得關注的是，ScGAD在pH 4.0～9.0反 應12 h仍 可 保 留70%以上殘余酶活力，比其他來源的GAD的pH穩(wěn)定范圍更寬泛[17，33]。因此，本研究中的ScGAD具有良好的熱穩(wěn)定性和寬泛的pH穩(wěn)定性，有利于其耐受食品加工過程中復雜多變的pH及溫度環(huán)境，在食品加工領域中具有廣闊應用前景。另外，ScGAD的催化反應體系不需要額外加入金屬離子，這與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[14]來源的GAD的性質相一致。此外，ScGAD的動力學參數(shù)Km為14.28 mmol/L，表明其對底物L-谷氨酸的親和力顯著高于植物來源GAD（米糠GAD，Km為37.30 mmol/L）[34]、（發(fā)芽粟谷GAD，Km為22.36 mmol/L）[35]以及微生物來源GAD（短乳桿菌CGMCC1306 GAD，Km為63.70 mmol/L）[19]?？傊?，ScGAD的優(yōu)良性質，能夠滿足食品工業(yè)應用的需求，以及對GABA的工業(yè)生產具有巨大的應用潛力。

另外，國內外對不同來源的GAD制備GABA也均有研究，李祥從乳酸菌中挖掘到一種谷氨酸脫羧酶LsGAD，其在添加6 g/L的L-谷氨酸后，24 h轉化率達到58%[36]；田靈芝等對植物乳桿菌來源的谷氨酸脫羧酶IPGAD進行了發(fā)酵優(yōu)化，在5 L發(fā)酵體系中，轉化24 h，生成GABA 204 g/L，轉化率達到97.92%[37]。作者通過全細胞制備GABA的最適條件研究發(fā)現(xiàn)，ScGAD的最適催化pH為4.0，這與其他研究者挖掘的其他來源的GAD的研究結果一致[38-39]；ScGAD最適催化溫度為60℃，而Yang等報道的唾液鏈球菌來源的酶最適催化溫度為55℃[40]，這可能是由于GAD的來源不同其性質大不相同；ScGAD反應體系中添加0.06 mmol/L PLP可有效提高GABA生成效率，這與徐林敏的報道研究[41]相一致；在最適催化條件下時，GABA的生成效率可達35.9 g/（g·h），反應2.5 h可將底物催化生成GABA，轉化率達到了99%，GABA質量濃度達到10.3 g/L。該產率還有待進一步提升，后續(xù)還將進行擴大反應體系以及加入分批補料后的催化研究，同時通過酶分子改造提升其酶催化效率及其工業(yè)應用價值。