慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者外周血中髓源性抑制細(xì)胞的變化及臨床意義

吳會會， 楊珺， 曾炫富， 王婭， 王勝軍,， 馬永明

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 3. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

慢性鼻竇炎伴鼻息肉(chronic sinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是多種炎性細(xì)胞參與并累及鼻腔和鼻竇黏膜的慢性炎性疾病，主要采用手術(shù)切除及輔以術(shù)后藥物治療，然而由于CRSwNP的具體發(fā)病機制不明，鼻息肉術(shù)后復(fù)發(fā)一直是困擾耳鼻喉科醫(yī)生的難題。CRSwNP最顯著的病理學(xué)特征是炎性細(xì)胞大量浸潤，其中約20%的細(xì)胞是嗜酸性粒細(xì)胞，相關(guān)研究顯示B細(xì)胞、漿細(xì)胞、特異性IgE在鼻息肉組織中表達(dá)上升[1-2]。

髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一類骨髓來源的、不成熟的且具有高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體，參與癌癥、慢性炎癥、感染、創(chuàng)傷、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3-5]。MDSCs在慢性炎癥條件下持續(xù)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，IL-6可通過STAT3依賴性機制上調(diào)MDSCs中趨化因子受體5(chemotactic cytokine receptor-5，CCR5)和精氨酸酶-1(arginase-1，ARG-1)的表達(dá)[6]。MDSCs根據(jù)表面標(biāo)志的不同分為HLA-DR-CD11b+CD33+MDSCs或HLA-DR-CD11b+CD33+CD14-CD15+粒細(xì)胞性MDSCs(PMN-MDSCs)，以及HLA-DR-CD11b+CD33+CD14+CD15-單核細(xì)胞性MDSCs(M-MDSCs)兩個亞型[7-8]。免疫抑制是MDSCs的主要特征，MDSCs介導(dǎo)的免疫抑制包括ARG-1、誘導(dǎo)型一氧化氮(iNOS)、活性氧和程序性細(xì)胞死亡配體1。MDSCs大量產(chǎn)生iNOS和ARG-1，通過促進(jìn)NO和活性氧產(chǎn)生而直接抑制T細(xì)胞功能[9]，而且其產(chǎn)生的ARG-1消耗精氨酸，使T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙[10]。也有研究表明，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中MDSCs依賴ARG-1促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[11]。本研究擬探討MDSCs是否參與了CRSwNP的發(fā)病過程，具體是哪一亞群參與了這一過程。

1 材料與方法

1.1 臨床血液標(biāo)本

收集2020年5月至2021年6月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科收治的CRSwNP患者31例，其中男20例，女11例，年齡17～76歲，平均49.37歲。所有患者均依據(jù)中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)[12]的診療標(biāo)準(zhǔn)明確診斷為CRSwNP，患者在門診行鼻內(nèi)鏡檢查，鼻竇CT薄層平掃確診為CRSwNP。所有納入研究的患者至少在手術(shù)前3個月內(nèi)停用全身糖皮質(zhì)激素，手術(shù)前1個月內(nèi)停用鼻用糖皮質(zhì)激素以及抗白三烯藥物。36例經(jīng)鼻竇薄層CT平掃確定無鼻竇炎鼻息肉的健康受試者被納入作為對照組，其中男20例，女16例，年齡20～79歲，平均44.50歲。取對照組和患者的EDTA抗凝外周靜脈血樣本，由于標(biāo)本的采集時間跨度較大，因此并非每個標(biāo)本都進(jìn)行了所有實驗。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

流式抗體抗人HLA-DR(PE-Cy7)、抗人CD11b(Brilliant Violent 510TM)、抗人CD33(FITC)、抗人CD14(APC)、抗人CD15(PE)(美國Biolegend公司)；抗人ARG1(PE)(英國eBioscience公司)；樣本密度分離液(天津灝洋華科生物科技有限公司)；細(xì)胞內(nèi)固定緩沖液、破膜緩沖液(美國Thermo Fisher公司)；人IL-6 ELISA試劑盒(南京福麥斯生物科技有限公司)；超速離心機、流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 提取外周血單個核細(xì)胞和血漿

取2 mL新鮮外周血(EDTA抗凝)，采用樣本密度分離液分離得到外周血單個核細(xì)胞和血漿，外周血單個核細(xì)胞立即進(jìn)行實驗，血漿存放于-80 ℃短期保存。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs比例

調(diào)整單個細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)量為106/100 μL緩沖液，加入單克隆HLA-DR(PE-Cy7)、CD11b(Brilliant Violent 510TM)、CD33(FITC)、CD14(APC)、CD15(PE)流式抗體，4 ℃條件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，500×g離心10 min，200 mL PBS重懸細(xì)胞，上機檢測目的細(xì)胞比例。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs細(xì)胞內(nèi)ARG-1的表達(dá)水平

調(diào)整單個細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)量為106/100 μL緩沖液，加入單克隆HLA-DR(PE-Cy7)、CD11b(Brilliant Violent 510TM)、CD33(FITC)流式抗體，4 ℃條件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，以300×g離心10 min，加入500 μL固定緩沖液，混勻，室溫條件下避光孵育15 min后，加入1 mL破膜緩沖液清洗2遍，300×g離心5 min，棄上清液，用50 μL破膜緩沖液重懸，加入抗人ARG-1(PE)，4 ℃條件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，500×g離心10 min，200 μL緩沖液重懸細(xì)胞，上機檢測HLA-DR-CD11b+CD33+總MDSCs細(xì)胞內(nèi)ARG-1細(xì)胞的表達(dá)情況。

1.6 ELISA檢測CRSwNP患者血漿IL-6的濃度

取-80 ℃條件保存的血漿100 μL，放至室溫，用IL-6 ELISA試劑盒檢測CRSwNP患者血漿IL-6的濃度，按照說明書的步驟進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上450 nm處讀取各孔的光密度值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后得到血漿IL-6濃度值，每組重復(fù)3次取平均數(shù)為檢測結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 CRSwNP患者外周血總MDSCs和PMN-MDSCs的比例升高，G-MDSCs的比例降低

CRSwNP患者外周血HLA-DR-CD11b+CD33+MDSCs細(xì)胞的比例(1.20%±0.92%)與對照組(0.49%±0.59%)相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.77,P<0.01)；CRSwNP患者HLA-DR-CD11b+CD33+CD14-CD15+PMN-MDSCs的細(xì)胞比例(56.52%±24.63%)與對照組(39.97%±26.86%)相比顯著升高，而HLA-DR-CD11b+CD33+CD14+CD15-M-MDSCs細(xì)胞比例(16.82%±14.71%)與對照組(25.77%±19.97%)相比顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.59,t=2.01,P均<0.05)。見圖1。

圖1 MDSCs及其亞群在外周血中的變化

2.2 CRSwNP患者外周血總MDSCs中ARG-1的表達(dá)增加

CRSwNP患者外周血總MDSCs中ARG-1的平均熒光強度(4 455±1 476)與對照組(2 584±1 151)相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.81,P<0.05)。見圖2。

圖2 總MDSCs細(xì)胞內(nèi)ARG-1的表達(dá)

2.3 CRSwNP患者血漿IL-6的濃度升高

CRSwNP患者血漿中IL-6濃度(15.48±8.54) pg/mL與對照組(8.27±3.49) pg/mL比較顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.24,P<0.05)。見圖3。

圖3 血漿中IL-6濃度比較

3 討論

CRSwNP是耳鼻咽喉頭頸外科的常見病、多發(fā)病，雖然近年來對CRSwNP的研究取得了較大進(jìn)展，但對其確切的發(fā)病機制仍知之甚少[13]。CRSwNP作為慢性鼻竇炎的一種類型，其發(fā)病或復(fù)發(fā)與病原微生物的感染、過敏性鼻炎、鼻腔結(jié)構(gòu)不良、纖毛功能不良、免疫功能異常等多種因素有關(guān)。目前研究表明CRSwNP具有高度的異質(zhì)性，不同種族、國家乃至不同地區(qū)的CRSwNP具有不同的免疫病理學(xué)特點[14]。CRSwNP病理生理學(xué)基礎(chǔ)是一種Th2主導(dǎo)的、持續(xù)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，雖然目前一般認(rèn)為在白種人中Th2細(xì)胞因子環(huán)境以及組織的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤是其主要病理特點，但在中國仍有將近一半的CRSwNP患者表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子環(huán)境以及嗜酸粒細(xì)胞性炎癥[15-18]。

關(guān)于MDSCs的報道始于20世紀(jì)70年代，F(xiàn)u等[19]研究表明，各種類型的髓樣細(xì)胞可以抑制癌癥的免疫功能。但是，這些細(xì)胞的具體性質(zhì)和生物學(xué)意義在很大程度上仍不清楚。有研究認(rèn)為Gr1+CD11b+細(xì)胞表型定義了小鼠脾臟中的免疫抑制髓系細(xì)胞，然而很快就發(fā)現(xiàn)CD11b+Gr-1+細(xì)胞是異質(zhì)性的。不同的表型標(biāo)準(zhǔn)和多種作用機制被用來定義這些細(xì)胞。2000年，為了統(tǒng)一對這些細(xì)胞的描述，提出了MDSCs這個名稱。MDSCs在健康條件下無法檢測到，但在懷孕期間、新生兒和病理情況下(如腫瘤或慢性感染)可檢測到[20]。MDSCs是慢性炎癥的標(biāo)志，可以提高癌癥患者對免疫治療的耐受力，因此消除MDSCs是目前的共識，并且在腫瘤的免疫治療中靶向MDSCs取得了令人欣喜的進(jìn)展[21]。

本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CRSwNP患者外周血中總MDSCs和PMN-MDSCs細(xì)胞比例明顯升高，而M-MDSCs細(xì)胞比例顯著降低，進(jìn)一步通過酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CRSwNP患者血漿IL-6濃度顯著升高。推測造成這一現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)機體處于慢性炎癥的病理環(huán)境下，包括IL-6在內(nèi)的細(xì)胞因子或炎癥因子大量產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子不僅可以阻滯不成熟髓系細(xì)胞的正常分化，還能誘導(dǎo)其成為MDSCs，并在患者外周血、骨髓或腫瘤組織內(nèi)大量募集、擴增、活化，通過抑制特異性免疫和非特異性免疫發(fā)揮其免疫抑制作用[22]。也有研究表明在腫瘤微環(huán)境中，MDSCs可與T細(xì)胞競爭使用對T細(xì)胞激活和增殖至關(guān)重要的半胱氨酸，導(dǎo)致T細(xì)胞不能從頭合成，從而阻礙抗腫瘤T細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[23-24]。IL-6是參與MDSCs分化的重要細(xì)胞因子，有研究表明與沒有IL-6參與分化的MDSCs相比，在IL-6存在下分化的MDSCs有更強的抑制CD8+T細(xì)胞的功能[6，25]。研究表明MDSCs產(chǎn)生ARG-1，ARG-1既可以通過促進(jìn)產(chǎn)生活性氧而直接抑制T細(xì)胞功能，又可以消耗精氨酸，使T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，而通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色發(fā)現(xiàn)總MDSCs細(xì)胞內(nèi)ARG-1的表達(dá)明顯升高。因此推測在鼻息肉的長期慢性炎癥刺激下，MDSCs通過產(chǎn)生ARG-1促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的功能。由于條件限制，本課題只研究了總MDSCs中ARG-1的表達(dá)情況，沒有進(jìn)一步研究是MDSCs的哪一亞群的變化導(dǎo)致ARG-1的升高。

機體在CRSwNP的長期慢性炎癥刺激下產(chǎn)生IL-6等炎癥因子，導(dǎo)致MDSCs的分化增多，增多的MDSCs通過產(chǎn)生ARG-1從而抑制T細(xì)胞的免疫功能，而鼻黏膜在長期慢性炎癥的刺激下導(dǎo)致了鼻息肉的形成。課題組將進(jìn)一步完善相關(guān)分子機制的研究，為CRSwNP的干預(yù)治療提供實驗依據(jù)。