橙皮素對糖尿病兔心肌缺血再灌注損傷氧化應激及凋亡作用的研究

楊 麗，張俊峰

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院心內科 200011)

心血管疾病是全球主要死亡原因之一[1]。糖尿病是心血管疾病和缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)最重要的危險因素，心血管疾病合并糖尿病患者的病死率是非糖尿病患者的2～6倍。心肌再灌注往往引起心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)[2]。糖尿病患者較健康人群發(fā)生MIRI的比例明顯升高[3]。糖尿病和IRI都可誘導心肌細胞氧化應激和凋亡。橙皮素具有顯著的抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用。研究報道橙皮素在腦、視網(wǎng)膜等器官IRI過程中具有保護作用[4-5]，而在糖尿病MIRI(D-MIRI)中的報道較少。本研究擬探討橙皮素在D-MIRI中是否抑制氧化應激及心肌細胞凋亡，從而發(fā)揮保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

雄性家兔24只，體重2.0～2.5 kg，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0004，飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物房。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會批準，并遵守3R保護原則進行實驗。

1.1.2試劑與儀器

橙皮素購自上海邁瑞爾化學技術有限公司(M18402-25G)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；末端DNA轉移酶dUPT缺口末端標記(TUNEL)試劑盒和蛋白酶K購自武漢賽維爾生物科技有限公司；DAB顯色劑購自德國DAKO公司。脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；烤箱(上海?，攲嶒瀮x器有限公司)；載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)；渦旋混合器(武漢賽維爾生物科技有限公司)；移液槍(中國北京Dragon公司)；顯微鏡(日本尼康Eclipse Ci-L)。

1.2 方法

1.2.1糖尿病兔造模

糖尿病兔模型制備方法：家兔禁食12 h，經(jīng)耳緣靜脈注射5%四氧嘧啶2 mL。每天上午抽取禁食12 h的家兔耳緣靜脈血進行血糖檢測，直到血糖持續(xù)7 d高于11.1 mmol/L，表明糖尿病兔模型建立成功。糖尿病兔自由飲水，單籠普食飼養(yǎng),飼養(yǎng)2周后制備MIRI模型。

1.2.2兔MIRI造模

由于兔心肌冠狀動脈左前降支較大鼠粗，制作MIRI模型成功率高，故該實驗選用兔心肌制作MIRI模型。方法參考文獻[6]，采用冠狀動脈左前降支結扎術構建兔MIRI模型。通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將兔麻醉。仰臥位固定在手術臺上,氣管插管輔助通氣。在胸部左側的第3～4肋間切開皮膚，然后鈍性分離，剝離肌肉，露出心臟。在左心耳下方1～2 mm處,以5-0無損傷縫合線在左冠狀動脈前降支下穿線,進針深度約1.5 mm，將縫線線節(jié)穿過內徑0.2 cm、長1 cm的硅膠管,避免結扎線切割血管，造成血管損傷，穩(wěn)定10 min后束緊結扎線,行左冠狀動脈缺血30 min,然后松開結扎線取出硅膠管；進行再灌注180 min。缺血成功的標準:結扎線以下心肌組織發(fā)紺。再灌注成功的標準:心肌局部反應性充血。

1.2.3動物分組

24只家兔隨機分為對照組、D-MIRI組、低劑量橙皮素+D-MIRI組(L-HSP+D-MIRI)、高劑量橙皮素+D-MIRI組(H-HSP+D-MIRI)，每組6只。除對照組，其余各組按上述方法制備兔D-MIRI模型。參照文獻[7]方法，L-HSP+D-MIRI組再灌注結束后開始應用橙皮素25 mg·kg-1·d-1灌胃干預1周。H-HSP+D-MIRI組再灌注結束后開始應用橙皮素50 mg·kg-1·d-1灌胃干預1周，其余2組應用等量生理鹽水灌胃干預。

1.2.4標本采集

1周后，將家兔處死，完整取出心臟，分離出左心室。將兔左心室分為3部分，一部分心肌組織用于SOD和MDA的檢測；一部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定行蘇木素-伊紅(HE)染色；最后一部分心肌組織于液氮速凍后，置于-80 ℃中保存，行心肌TUNEL檢測。

1.2.5氧化應激指標檢測

取部分缺血心肌組織，冰水浴條件下，機械勻漿，制備成10%的勻漿液，2 500～3 000 r/min，離心10 min，取上清液進行測定。根據(jù)SOD和MDA試劑盒說明書分別測量SOD和MDA水平。其中SOD水平用黃嘌呤氧化酶法，MDA水平用硫代巴比妥酸法。

1.2.6HE染色觀察心肌組織病理變化

取出固定在多聚甲醛中的心肌組織，梯度乙醇脫水透明，石蠟包埋，然后將組織切成5 μm厚的切片，HE染色后于光學顯微鏡下觀察心肌組織的病理學變化。

1.2.7TUNEL法檢測家兔心肌組織細胞凋亡

取出保存在-80 ℃冰箱中的兔心肌組織行TUNEL檢測，使用TUNEL試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，G1507)對心肌細胞的凋亡情況進行檢測。具體步驟如下：兔心肌組織制備冰凍切片，切片厚度為8～12 μm。滴加適量TUNEL反應液，37 ℃溫箱孵育30 min。將切片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，陽性為細胞核呈棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復染約3 min。最后脫水、中性樹膠封片。每個標本計數(shù)8個高倍鏡(×200)視野內的所有陽性細胞數(shù)和所有細胞數(shù)，細胞凋亡率(%)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。每張切片由2名觀察者分別讀片，計算平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組兔心肌組織中氧化應激指標的比較

D-MIRI組、L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌組織SOD水平低于對照組(P<0.05)，L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組高于D-MIRI組(P<0.05)，H-HSP+D-MIRI組高于L-HSP+D-MIRI組(P<0.05)。D-MIRI組、L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌組織MDA水平高于對照組(P<0.05)，L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組低于D-MIRI組(P<0.05)，H-HSP+D-MIRI組低于L-HSP+D-MIRI組(P<0.05)。見表1。

表1 4組家兔心肌組織SOD、MDA及細胞凋亡率變化

2.2 各組家兔心肌組織的病理變化

對照組心肌未見明顯變性，排列規(guī)則，肌絲相對完整，細胞間隙均勻。D-MIRI組心肌組織水腫明顯，排列不規(guī)則，肌絲不完整，細胞間隙增大，不均勻。L-HSP+D-MIRI組心肌組織水腫，排列尚規(guī)則，肌絲尚完整，細胞間隙增大，不均勻，較D-MIRI組癥狀輕。H-HSP+D-MIRI組心肌組織稍水腫，排列規(guī)則，肌絲尚完整，細胞間隙增大，尚均勻，較L-HSP+D-MIRI組癥狀輕。見圖1。

2.3 各組家兔心肌組織細胞凋亡變化

采用TUNEL法檢測各組心肌組織細胞凋亡變化，光鏡下可見TUNEL染色陽性細胞表現(xiàn)為棕黃色。D-MIRI組、L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)。L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌細胞凋亡率低于D-MIRI組(P<0.05)。H-HSP+D-MIRI組心肌細胞凋亡率低于L-HSP+D-MIRI組(P<0.05)。見表1、圖2。

A：對照組；B：D-MIRI組；C：L-HSP+D-MIRI組；D： H-HSP+D-MIRI組；黑色箭頭表示心肌細胞腫脹、細胞間隙增大等組織病理學改變。

A：對照組；B：D-MIRI組；C：L-HSP+D-MIRI組；D： H-HSP+D-MIRI組；黑色箭頭表示凋亡細胞。

3 討 論

糖尿病引起的心血管疾病是人類高死亡率的重要原因之一，D-MIRI的發(fā)病率逐年上升。糖尿病可引起內皮功能障礙、胰島素抵抗、心肌代謝異常等多種功能障礙。與非糖尿病患者比較，糖尿病患者患心血管疾病的風險增加了2～4倍[8]。此外，在急性MIRI的臨床情況下，糖尿病患者的臨床預后更差，包括急性心肌梗死、冠狀動脈血管成形術，提示糖尿病患者可能更容易發(fā)生急性MIRI[9]。MIRI的病理生理機制可能與氧化應激、炎性反應、酸中毒、線粒體功能失調、心肌纖維能量代謝障礙等相關,其中氧化應激反應在MIRI中至關重要[10]。

IRI通常與微血管損傷有關，特別是毛細血管和小動脈的通透性增加，從而導致組織間質擴散和液體過濾增加。缺血后，血液重新進入組織，導致大量氧自由基的釋放。這些氧自由基引發(fā)酶促反應，導致細胞膜的氧化損傷，以及有毒代謝物的產(chǎn)生和涉及DNA、蛋白質和脂類的細胞損傷。氧化應激與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關，表現(xiàn)為活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生和抗氧化酶的消耗[11]。過量的ROS可破壞細胞和線粒體的雙層膜，引起膜脂質過氧化反應，這被認為是導致線粒體和細胞功能障礙，特別是細胞凋亡的主要機制[12]。

糖尿病心肌ROS生成的增加是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要因素[13]。高血糖可導致ROS的產(chǎn)生增加，最終導致血管功能障礙。高血糖引起的氧化應激導致肌肉和脂肪細胞攝取葡萄糖不足。此外，高血糖引起的氧化應激可促進β細胞功能障礙，減少β細胞分泌胰島素[14]，這樣也會導致高血糖進一步加重。在高血糖狀態(tài)下，ROS聚積，破壞DNA和蛋白質，損傷心肌細胞。同時，高血糖引起的ROS積累可引發(fā)胰島素抵抗。當肌肉、脂肪和肝臟中的細胞對胰島素沒有適當?shù)姆磻⑶也荒軓难褐袛z取葡萄糖以獲得能量時，就會發(fā)生胰島素抵抗。因此，胰腺會產(chǎn)生更多的胰島素,這些特征共同構成了心血管疾病的主要風險。高血糖引起的氧化應激在心血管功能障礙中發(fā)揮著重要作用，兩者相互作用、相互影響[15]。MDA是脂質過氧化產(chǎn)物，可進一步誘導ROS的產(chǎn)生，抑制抗氧化系統(tǒng)，加重損傷。SOD可清除ROS，增強抗氧化系統(tǒng)，保護心肌細胞。機體內SOD及MDA水平可間接反映機體的抗氧化應激能力和細胞受氧化損傷的嚴重程度。

心肌細胞凋亡是心肌在病理因素的作用下發(fā)生的主動而有序的程序性死亡。IRI的發(fā)病機制是多因素性的,細胞凋亡是IRI的主要致病機制之一。心肌細胞是不可再生的細胞,心肌細胞凋亡會導致心肌收縮功能障礙。因此,抑制心肌細胞凋亡是減輕心肌梗死患者心肌損傷的有效途徑之一。缺血會引起心肌細胞凋亡,再灌注則會進一步加重心肌細胞凋亡,抑制心肌細胞凋亡有助于減輕IRI對心臟的損傷。糖尿病加重MIRI的發(fā)病機制尚不完全清楚。糖尿病可導致ROS的過度產(chǎn)生，當MIRI發(fā)生時，離子通道開放(如K+外排)增加ROS的產(chǎn)生，在D-MIRI過程中，過度氧化應激可誘導心肌細胞凋亡、壞死和炎性反應，是MIRI的發(fā)生機制[16]。糖尿病模型中，激活AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)可能對IRI引起的心臟損傷具有保護作用。研究表明，糖尿病通過下調BAG3/Bcl-2/Nrf-2/HO-1的表達，增加p22/p67/Caspase 3/PARP表達介導氧化損傷，加重了IRI誘導的心肌功能障礙[17]。

橙皮素主要來源于蕓香科柑橘屬幼果，屬于二氫黃酮中的一種,呈淡黃色針狀結晶或粉末。難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。橙皮素是柑橘果皮中主要藥理活性成分，其主要治療作用是抗氧化和自由基清除[18]。LI等[19]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素可上調SOD表達，發(fā)揮抗氧化作用。橙皮素的抗氧化作用與清除自由基和增強抗氧化防御系統(tǒng)有關[20]。研究表明橙皮素可減少脂多糖誘導的H9C2心肌細胞線粒體依賴性細胞凋亡[21]。本研究中，橙皮素明顯提高了D-MIRI兔心肌組織中的SOD水平，降低MDA水平和心肌細胞凋亡率，表明橙皮素可抑制D-MIRI兔的氧化應激反應和心肌細胞凋亡，與之前的研究結果一致。

綜上所述，橙皮素可能是一種治療D-MIRI的潛在藥物，通過抑制心肌細胞氧化應激和凋亡，從而對MIRI發(fā)揮保護作用。本研究結果進一步豐富了橙皮素治療糖尿病患者心肌MIRI的理論基礎，為研究橙皮素抗心肌氧化應激、細胞凋亡的分子機制奠定了基礎。橙皮素處理后可以同時抑制心肌氧化應激和細胞凋亡，產(chǎn)生保護作用，但是哪一個機制在D-MIRI中發(fā)揮主要作用仍不清楚，需要更進一步的實驗研究證明。