珍珠粉在組織工程中應(yīng)用進(jìn)展*

王雅雯 綜述,徐 普 審校

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院/海南省口腔醫(yī)學(xué)中心 口腔種植科，?？?570208)

珍珠是雙殼綱軟體動物的外套膜受到外界刺激時，由珍珠囊內(nèi)的上皮細(xì)胞分泌的碳酸鈣(CaCO3)層層包裹異物所形成。將珍珠粉碎磨細(xì)得到的粉狀物即珍珠粉，可分為淡水珍珠粉和海水珍珠粉[1]。千年來，珍珠粉或作為中藥，或?yàn)槊廊萦闷繁蝗藗儚V泛使用。近年來，隨著檢測技術(shù)的更新，加工工藝的改進(jìn)，珍珠粉的更多功效，如抗驚厥、抗氧化、抗衰老和抗輻射等也逐漸被人們所知曉[2-6]。除此之外，珍珠粉在修復(fù)組織缺損中的作用同樣受到許多學(xué)者的關(guān)注。本文將對珍珠粉在組織工程中的應(yīng)用進(jìn)行簡單總結(jié)，為珍珠粉的臨床運(yùn)用提供新的思路。

1 珍珠粉成分的研究

珍珠由無機(jī)基質(zhì)、有機(jī)基質(zhì)和微量元素構(gòu)成。珍珠粉的無機(jī)基質(zhì)成分主要為CaCO3和碳酸鎂(MgCO3)，還有少量的二氧化硅(SiO2)、磷酸鈣[Ca3(PO4)2]、氧化鋁和氧化鐵，約占總質(zhì)量的95%，而有機(jī)基質(zhì)含量為5%，主要有蛋白質(zhì)、糖蛋白和多糖。此外，珍珠還含有鈣、鈉、錳、硒、鋁和銅等多種微量元素[7-8]。有研究表明，珍珠母貝生長水域不同、種類不同及同種類個體差異，珍珠中的微量元素也有所不同。此外，珍珠粉的成分還受加工工藝的影響[9-10]。有學(xué)者通過對水溶性珍珠粉的成分進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，水溶性珍珠粉中含有多種氨基酸，其中包含人體所需的8種必需氨基酸，同時還發(fā)現(xiàn)多種微量元素，主要為鈣、錳、鎂等[3]。

2 珍珠粉在組織工程中的應(yīng)用

2.1 珍珠粉在軟組織創(chuàng)傷中的應(yīng)用

急性損傷，包括燒傷和潰瘍，愈合過程起始于中性粒細(xì)胞釋放各類蛋白酶，血管擴(kuò)張引起通透性升高，隨后角質(zhì)形成細(xì)胞遷移到損傷部位，并在此處形成新的血管，成纖維細(xì)胞分化形成膠原細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[11]。珍珠粉含有的活性成分，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)傷口愈合。有學(xué)者以大鼠為實(shí)驗(yàn)動物模型，探討珍珠粉對創(chuàng)傷愈合的影響。研究選取大鼠胸腹交界處腹側(cè)部皮膚，在真皮層與皮下組織間做一斜形切口，植入珍珠粉與血液的混合物，用可吸收線進(jìn)行縫合。術(shù)后1 d內(nèi)切口迅速愈合，術(shù)后10 d手術(shù)斑痕消失，而對照組則需要14 d。珍珠粉混合物發(fā)生降解，大量血管生成，成纖維細(xì)胞增殖合成膠原纖維，顯示了良好的皮膚再生潛力[12]。CHEN等[13]選用不同粒徑的珍珠粉分別進(jìn)行體外和體內(nèi)研究。結(jié)果顯示，珍珠粉能促進(jìn)人成纖維細(xì)胞存活，同時增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。隨后的體內(nèi)研究結(jié)果也證實(shí)，珍珠粉能促進(jìn)大鼠表皮膠原蛋白形成，增強(qiáng)血管生成能力，加速創(chuàng)面的愈合，而且珍珠粉對大鼠的破損的皮膚無刺激作用。研究還發(fā)現(xiàn)納米級珍珠粉作用效果是最好的，珍珠粉研磨得越細(xì)，粒徑越小更能促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

學(xué)者們對珍珠粉的研究不僅局限于珍珠粉，珍珠粉的水溶性基質(zhì)也是他們研究的對象。有學(xué)者將珍珠提取物浸泡于DMEM培養(yǎng)基中，過濾后作用于人成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)人成纖維細(xì)胞的遷移，且Ⅲ型膠原蛋白的mRNA的表達(dá)升高[14]。LEE等[15]首先構(gòu)建豬皮膚二級燒傷動物模型，將珍珠粉的水溶性基質(zhì)與膠原蛋白混合，置于燒傷創(chuàng)面上，發(fā)現(xiàn)該混合物能誘導(dǎo)創(chuàng)面肉芽組織形成。肉眼可見在受傷的真皮和表皮上形成自然的皮膚外觀，通過蘇木素-伊紅(HE)染色觀察到受傷創(chuàng)面內(nèi)血管生成和新生結(jié)締組織再生。隨后用珍珠粉提取液處理小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，膠原生成增加，珍珠層水溶性成分具有更好的內(nèi)在生物相容性和更大的創(chuàng)面愈合潛力。通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)珍珠的水溶性基質(zhì)能作為皮膚的替代物促進(jìn)豬皮膚二級燒傷創(chuàng)面的愈合。還有學(xué)者采用二氧化碳超臨界萃取工藝提取珍珠粉的水溶性成分，同樣證明珍珠粉的水溶性提取物能促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，改善體內(nèi)膠原蛋白的形成，從而提高傷口愈合能力[16]。

2.2 珍珠粉在骨組織中的應(yīng)用

珍珠具有獨(dú)特的砌塊和砂漿結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，具有比透明質(zhì)酸(HA)更高的成骨活性。同時，珍珠粉還可作為生物活性顆粒填充劑與其他支架材料或是生長因子形成復(fù)合支架，既可以促進(jìn)骨骼生長，又可以增強(qiáng)復(fù)合材料的強(qiáng)度[17-18]。由于珍珠粉良好的生物相容性、生物降解性和成骨性使其可能成為一種很有前途的骨修復(fù)材料。

2.2.1珍珠粉在骨組織工程中的運(yùn)用

珍珠粉的水溶性基質(zhì)中含有多種蛋白，這些蛋白不僅能加速碳酸鈣晶體的形成，還可以促進(jìn)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性，調(diào)控Wnt抑制因子-1 (Wnt inhibitory factor-1,Wnt-1)和細(xì)胞粘合素，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)成骨[19]。與單獨(dú)碳酸鈣溶液比較，珍珠的水溶性基質(zhì)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化，還能通過抑制組織蛋白酶的活性來減緩破骨細(xì)胞的活性，達(dá)到抑制骨吸收的作用，證明珍珠的水溶性基質(zhì)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化[20]。CHAATURVEDI等[21]將珍珠粉的水溶性基質(zhì)分別作用于小鼠顱頂前成骨(preosteoblast of Mus musculus calvaria，MC3T3-E1)細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞(human keratinocytes，Hacat)，檢測ALP和成骨分化基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ALP、骨鈣素(osteocalcin,OCN)和Ⅰ型膠原A2蛋白(collagen-Ⅰ A2,COL-1A2)的表達(dá)升高，細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，提示珍珠粉的水溶性基質(zhì)有良好的促成骨性能。此外，將珍珠片與原代培養(yǎng)的人骨細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與磷酸三鈣組比較，珍珠粉共培養(yǎng)組的ALP、骨唾液蛋白(bone sialoprotein,BSP)和OCN的基因表達(dá)均升高，提示珍珠可能具有促進(jìn)人骨細(xì)胞成骨分化的能力[22]。毛秋華等[23]通過磨法制備納米珍珠粉，并進(jìn)行一系列體內(nèi)及體外研究。結(jié)果顯示，納米珍珠粉具有良好的生物相容性和成骨性能。同時研究還發(fā)現(xiàn)，納米級珍珠粉的水溶性基質(zhì)可以促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖和分化，提高細(xì)胞的成骨活性[23-26]。

2.2.2珍珠粉支架材料在骨組織工程中的運(yùn)用

正因?yàn)檎渲榉凼且环N無毒、無刺激性、具有生物活性的物質(zhì)，許多學(xué)者將目光聚焦到珍珠粉與支架材料或是生長因子混合，構(gòu)建復(fù)合支架材料，以期更好地發(fā)揮珍珠粉生物活性。

將珍珠粉作為填充劑對聚丙烯單絲進(jìn)行改性，力學(xué)性能分析顯示改性后的聚丙烯單絲抗拉伸強(qiáng)度和伸長率均能滿足要求；掃描電鏡(SEM)圖像顯示，聚丙烯單絲表面有大量珍珠粉及細(xì)胞生長；同時采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法和共聚焦顯微鏡檢測改性后樣品的生物相容性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改性后的聚丙烯單絲能促進(jìn)鼠成纖維細(xì)胞系L929細(xì)胞和豬內(nèi)皮細(xì)胞(porcine endothelial cell,PIEC)的增殖[27]。YANG 等[28]將納米珍珠粉/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactide-co-glycolide,PLGA)復(fù)合支架與小鼠MC3T3- E1 細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合支架能促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的黏附、增殖和分化。還有學(xué)者采用原位熔融縮聚法制備珍珠粉/聚氨基酸(PAA)復(fù)合材料，并對該復(fù)合材料進(jìn)行力學(xué)性能、生物相容性和成骨活性等研究，結(jié)果表明，與珍珠粉相比，珍珠粉/PAA復(fù)合材料具有優(yōu)于珍珠粉的力學(xué)性能、更高的生物活性和成骨能力。珍珠粉/PAA復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度、抗彎強(qiáng)度和抗拉強(qiáng)度均達(dá)到良好的數(shù)值，此外，珍珠粉/PAA復(fù)合材料由于摻入珍珠粉和PAA顯示更強(qiáng)的礦化能力和生物活性，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在復(fù)合材料表面顯現(xiàn)更高的細(xì)胞增殖和黏附能力，細(xì)胞ALP活性升高，成骨分化相關(guān)基因(COL 1，RunX2，OCN和OPN)表達(dá)上調(diào)。珍珠粉/PAA復(fù)合材料作為用于裝載承受骨修復(fù)的新型骨誘導(dǎo)復(fù)合材料，將成為有前途的候選材料，為臨床的骨缺損修復(fù)提供一種新的選擇[29]。還有研究將聚倍半氧烷、珍珠粉和地塞米松負(fù)載多孔碳納米纖維通過靜電紡絲法制備到聚乳酸納米纖維支架中，用于骨組織再生研究。結(jié)果顯示，在復(fù)合支架上培養(yǎng)的BMSCs具有較高的增殖率，ALP水平和鈣沉積升高，具有較好的生物相容性和加速BMSCs成骨分化能力[30]。

骨組織工程包括三要素：種子細(xì)胞、生物活性因子及支架材料[31]。HA是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，存在于很多結(jié)締組織中，具有良好的骨誘導(dǎo)性和促血管形成的能力，同時還能介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞黏附與增殖、分化，是一種常見的支架材料[32]。LI等[33]隊(duì)通過冷凍干燥法制備納米珍珠粉與殼聚糖-透明質(zhì)酸(chitosan-hyaluronic acid,C-HA)復(fù)合支架材料，并對該支架材料的性能、生物相容性和成骨效果進(jìn)行評價。研究結(jié)果顯示，與對照組比較，Ⅰ型膠原蛋白(collagen-Ⅰ,COL-1)、OCN、OPN和Runx2基因的表達(dá)升高，提示該支架材料能促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。同時發(fā)現(xiàn)納米珍珠粉的比例可影響細(xì)胞的增殖、分化與支架材料的親水性和機(jī)械強(qiáng)度，隨著納米珍珠粉含量的增加，支架的親水性和機(jī)械強(qiáng)度有所提高，ALP活性升高，納米珍珠粉比例為(10～25 wt.%)的支架材料可更有效地促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和分化，但隨著NPP含量的增加，支架的孔隙率會受到影響。體外修復(fù)兔股骨遠(yuǎn)端骨缺損的研究中也發(fā)現(xiàn)該材料具有良好生物相容性和促成骨特性。一系列的研究證實(shí)了納米珍珠粉/C-HA復(fù)合支架材料具有良好的生物相容性和成骨效果[33-34]。骨形成過程中有許多生長因子參與，骨形態(tài)蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)是一類非種屬特異性且結(jié)構(gòu)高度保守的功能蛋白，具有良好的骨誘導(dǎo)活性，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)形成和重建等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[35]，在支架材料中加入BMP-2可能是材料成骨性能的有利因素。

雖然應(yīng)用傳統(tǒng)方法制作骨組織工程支架材料取得了一定成就，但在支架的三維結(jié)構(gòu)、力學(xué)強(qiáng)度、支架個性化方面存在著缺陷，影響臨床應(yīng)用效果。3D 打印技術(shù)制作的骨組織工程支架在力學(xué)、結(jié)構(gòu)、個性化方面有其獨(dú)特優(yōu)勢，通過3D 打印技術(shù)制作支架的方法有望改變以上不足[36-37]。ZHANG等[38]用3D打印技術(shù)制備了不同濃度的珍珠粉(30～80 wt.%)/聚乙酸內(nèi)酯(poly-caprolactone,PCL)復(fù)合支架并進(jìn)行相關(guān)的研究。研究發(fā)現(xiàn)3D打印可以嚴(yán)格調(diào)控支架的孔隙大小和孔隙形態(tài)，影響營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和組織的生長，且珍珠粉/PCL復(fù)合支架的理化和生物學(xué)性能與珍珠粉濃度密切相關(guān)。當(dāng)支架內(nèi)珍珠粉濃度增加時，抗壓強(qiáng)度和磷灰石形成增加，細(xì)胞黏附、增殖和成骨分化能力也增加。此外，還有學(xué)者通過3D打印制備珍珠粉/CaSO4復(fù)合支架，隨后對支架性能及成骨特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，該支架呈現(xiàn)出均勻纏繞的大孔，孔隙率高，且抗壓強(qiáng)度(8 MPa)增強(qiáng)，與天然骨的抗壓強(qiáng)度相當(dāng)，是石膏、CaSO4支架抗壓強(qiáng)度(3 MPa)的2倍。體外實(shí)驗(yàn)顯示該支架能促進(jìn)恒河猴BMSCs(rBMSCs)的增殖和分化，并增強(qiáng)相關(guān)成骨基因的表達(dá)。在兔股骨髁缺損處植入此支架材料，通過顯微計算機(jī)斷層和組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在植入材料8周后有新骨形成[39]。

3 小 結(jié)

由于珍珠粉所具有的良好生物相容性和生物活性，被認(rèn)為是一種優(yōu)秀的天然生物材料，但在組織工程的應(yīng)用過程中，珍珠粉同樣面臨著各種問題，這既是機(jī)遇也是挑戰(zhàn)。隨著技術(shù)的迭代，將傳統(tǒng)工藝的優(yōu)勢與新工藝的通用性相結(jié)合，有望在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)珍珠粉作為新材料的優(yōu)勢性能，更好地服務(wù)臨床。