GC夾對三種食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE圖譜的影響

廖超張昭寰姚鑫謝晶張煒佳，3潘迎捷，3趙勇，3

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

GC夾對三種食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE圖譜的影響

廖超1，2張昭寰1，2姚鑫1，2謝晶1張煒佳1，2，3潘迎捷1，2，3趙勇1，2，3

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

旨在探討不同的GC夾以及GC夾連接引物的不同位置對3種食源性致病菌的DGGE圖譜結(jié)果的影響，合成6對RNA聚合酶β亞基編碼基因rpoB引物（rpoB 1-6），含3種不同GC夾（GC-1，GC-2，GC-3），且每種GC夾分別連接于正反引物5'端。應(yīng)用rpoB-PCR-DGGE 對副溶血性弧菌（5株），單增李斯特菌（5株）和沙門氏菌（3株）進(jìn)行分析，并與V3-PCR-DGGE和ERIC-PCR的圖譜及聚類分析結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，GC-3夾連接于反引物上的rpoB-PCR-DGGE分辨效果最好，分辨力指數(shù)達(dá)0.9，與ERIC-PCR相同，高于V3-PCR-DGGE。GC夾序列和連接引物位置均對rpoB-PCR-DGGE圖譜結(jié)果產(chǎn)生影響。選擇或設(shè)計無連續(xù)鳥嘌呤（G）排列的GC夾序列且將其連接于反引物5'端，均能有效提高rpoB-PCR-DGGE對食源性致病菌檢測與分型的效果。

副溶血性弧菌；單增李斯特菌；沙門氏菌；GC夾；rpoB-PCR-DGGE

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了一系列的食源性致病菌流行病學(xué)調(diào)查方法，如脈沖電場凝膠電泳（PFGE）［1］、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）［2］、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）［3］、重復(fù)元素多態(tài)性（REP-PCR）［4］，以及多位點(diǎn)序列分型（MLST）［5］等技術(shù)。其中，ERIC-PCR是基于“腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列”（Enterobacterial repetitive intergenic conse-nsus，ERIC）的分型方法，具有分辨率較高、準(zhǔn)確性好、簡便快捷、無需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)［6］。此外，變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一種廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域的微生物群落多樣性分析和種群動態(tài)監(jiān)測的分子生物學(xué)技術(shù)。近幾年，DGGE技術(shù)也被應(yīng)用于食源性致病微生物的快速檢測與分型［7］。

基于16S rDNA中V3區(qū)的PCR-DGGE常用于微生物群落多樣性分析和食源性致病菌的快速檢測與分型的研究［8，9］。但此方法同時存在一定的缺陷，如單一菌可能在DGGE指紋圖譜中含有多譜帶［10］。然而，RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB具有高度的保守性，單拷貝以及更高分辨率的特點(diǎn)，與PCRDGGE技術(shù)相結(jié)合使得單一菌在DGGE指紋圖譜中只存在單譜帶，從而使得PCR-DGGE方法用于研究微生物群落 多樣性，微生物檢測與分型的結(jié)果更為準(zhǔn)確［11］。為提高DGGE技術(shù)對DNA片段序列差異分辨率，通常在一 側(cè)引物5'端連接一段30-50 bp富含G、C堿基的DNA片段（GC夾）。Sheffield等［12］發(fā)現(xiàn)40 bp的GC夾足夠滿足DGGE對微生物多樣性的研究。然而，目前關(guān)于GC夾的變化對微生物群落多樣性和檢測分型結(jié)果影響的研究較少。

本研究以5株副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），5株單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和3株沙門氏菌（Salmonella spp.）為研究對象，討論不同GC夾和GC夾的不同引物連接位置（正反引物的5'端）對3種（13株）食源性致病菌的rpoBPCR-DGGE檢測與分型結(jié)果的影響，并與V3-PCRDGGE和ERIC-PCR兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株副溶血性弧菌：3株來源于美國典型菌種保藏中心（ATCC）：ATCC 33846、ATCC 33847、ATCC17802；1株來源于實(shí)驗(yàn)室分離：F18；1株來源于臨床分離：O3：K6。5株單增李斯特菌均來自于ATCC：ATCC 19112、ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116、ATCC 19118。3株 沙 門 氏菌：2株來源于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）：腸炎沙門氏菌 CMCC 50041、乙型副傷寒沙門氏菌 CMCC 50094；1株來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）：鼠傷寒沙門氏菌 CICC 21484。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀，德國Eppendorf公司；DGGE電泳儀The DcodeTMUniversal Mutation Detection System，美國Bio-Rad公司；TIANamp Bacteria DNA Kit，北京Tiangen公司；Premix rTaq，寶生物工程（大連）有限公司。胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、溶菌肉湯（LB）、腦心浸液（BHI）、弧菌選擇性瓊脂（TCBS）、李斯特菌選擇性瓊脂（PALCAM）、沙門氏菌選擇性瓊脂（BS），北京路橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA提取 將13株菌種（5株副溶血性弧菌，5株單增李斯特菌，3株沙門氏菌）分別劃線接種于選擇性培養(yǎng)基TCBS、PALCAM、BS上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)18-24 h。依次挑取單菌落接種于TSB（含3% NaCl）、BHI、LB中，于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h，連續(xù)活化2次。收集菌體沉淀，使用TIANamp Bacteria DNA Kit進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，詳細(xì)步驟見試劑盒說明書。其中，蛋白酶K處理時間延長至1 h，溶菌酶處理時間延長至0.5 h［13］。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 本研究所用的引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，詳細(xì)序列見表1和表2。

PCR擴(kuò)增體系溶液總體積為25 μL，其中包含Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL（其中，Taq酶0.625 U；2× dNTP各0.4 mmol/L；2× Taq Buffer 4 mmol/L Mg2+），正反引物各1 μL（各20 μmol/L），DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。rpoB降落PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，53-48℃ 30 s，72℃1 min（其中每個循環(huán)后復(fù)性溫度下降0.5℃）；10個循環(huán)后進(jìn)入第二個循環(huán)程序：94℃ 1 min，50℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環(huán)后；72℃持續(xù)7 min。V3-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 3 min；95℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；最后72℃持續(xù)5 min。ERIC-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7 min；94℃1 min，52℃ 1 min，65℃ 8 min，共30個循環(huán)；最后65℃維持16 min。檢測方法：取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%（rpoB-PCR，V3-PCR）和1%（ERIC-PCR）瓊脂糖凝膠，于5 V/cm電壓下電泳30 min后于凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

表2 三種食源性致病菌檢測與分型方法的相關(guān)基因和不同GC夾子

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE） DGGE指紋圖譜構(gòu)建采用DcodeTM系統(tǒng)（Bio-Rad）。V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠中分離，變性梯度為40%-60%。其運(yùn)行條件：1×TAE電泳緩沖液，溫度60℃，電壓60 V，時間16 h，每個樣品點(diǎn)樣量為15 μL PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束后用15 mL 1×SYBR Green染色，在紫外燈下用凝膠成像儀拍照成像。rpoB基因擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠中分離，變性梯度為35%-55%。其運(yùn)行條件：1×TAE電泳緩沖液，60℃，100 V，10 h，每個樣品點(diǎn)樣量為15 μL PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束后用15 mL 1×SYBR Green染色，在紫外燈下用凝膠成像儀拍照成像。

1.2.4 DGGE圖譜和ERIC-PCR圖譜分析 應(yīng)用Quantity One（Bio-Rad）凝膠圖譜分析軟件對成像所得DGGE圖譜和ERIC-PCR圖譜進(jìn)行分析，通過泳道和條帶的檢測與匹配，獲得條帶相對電泳距離值（Rf values），從而構(gòu)建圖譜泳道之間的相似性矩陣。然后應(yīng)用PAST ver.1.79分析軟件選擇Paired group算法對圖譜進(jìn)行聚類分析［18］。使用Hunter和Gaston的方法計算出分型方法的分辨力指數(shù)［19］。公式如下：

其中，N表示實(shí)驗(yàn)中總菌株數(shù)，S表示聚類分析的總類型數(shù)，表示第j個類型中含有的菌株總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 三種GC夾、兩種連接位置的rpoB-PCR-DGGE指紋圖譜的構(gòu)建及分析

總體觀察指紋圖譜（圖1），rpoB-PCR-DGGE能將3種食源性致病菌完全區(qū)分開。然而，5株副溶血性弧菌中，只有ATCC 33846被區(qū)分開。對于5株單增李斯菌，則情況不一。最多分為4類：如圖1-C和圖1-F所示。最少分為3類：如圖1-A，1-B，1-D，1-E所示。且圖1-A和1-B中，ATCC 19112沒有譜帶出現(xiàn)。對于3株沙門氏菌，圖1-A，1-C，1-E中沒有區(qū)分開，而圖1-B，1-D，1-F中 CICC 21484被區(qū)分開。

縱向比較圖1-A、1-C、1-E以及圖1-B、1-D、1-F發(fā)現(xiàn)，基于不同GC夾連接于引物的相同位置的rpoB-PCR-DGGE，對5株副溶血性弧菌和3株沙門氏菌的分辨效果無顯著差別。但是，對于5株單增李斯特菌，其分型效果差別較大。菌株ATCC 19115和ATCC 19116始終處于同一水平位置上，菌株ATCC 19118譜帶位置處于前兩株菌株的上方。另外兩株菌ATCC 19112和ATCC 19114譜帶位置存在變化?；贕C-2連接于正引物（圖1-C）和GC-3連接于反引物（圖1-F）的rpoB-PCR-DGGE將5株單增李斯特菌區(qū)分成了四類。

圖1 三種食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE指紋圖譜

橫向比較圖1-A和1-B、圖1-C和1-D，圖1-E和1-F觀察到，基于相同GC夾連接于引物不同位置的rpoB-PCR-DGGE，對5株副溶血性弧菌分型效果無任何影響。而對5株單增李斯特菌，影響較大。其中，菌株ATCC 19115、ATCC19116和 ATCC 19118的譜帶在DGGE圖譜中的位置無變化，菌株ATCC 19112和ATCC 19114的譜帶位置變化明顯。對于3株沙門氏菌，基于GC連接于正引物的rpoB-PCR-DGGE（圖1-A、1-C、1-E）未將其區(qū)分開，且譜帶均呈彌散狀態(tài)。而基于GC連接于反引物的DGGE圖譜中（圖1-B、1-D、1-F），菌株CICC 21484被區(qū)分開，譜帶無彌散。

經(jīng)以上比較與分析，可知應(yīng)用rpoB-PCR-DGGE對13株食源性致病菌檢測與分型效果最好的圖譜為圖1-F，即GC-3連接于rpoB的反引物上。

2.2 V3-PCR-DGGE的指紋圖譜的構(gòu)建及分析

13株食源性致病菌基于V3-PCR-DGGE所構(gòu)建的圖譜（圖2）顯示，副溶血性弧菌和沙門氏菌中出現(xiàn)單一菌株存在多條譜帶的現(xiàn)象，然而，單增李斯特菌單一菌株都只對應(yīng)1條譜帶。5株副溶血性弧菌株中，在DGGE圖譜上只出現(xiàn)1條譜帶的是O3：K6，出現(xiàn)2條譜帶的是ATCC 33846和ATCC 17802，出現(xiàn)3條譜帶的是ATCC 33847，出現(xiàn)5條譜帶的是F18。對于3株沙門氏菌，菌株CMCC 50041只出現(xiàn)1條譜帶，菌株CMCC 50094出現(xiàn)約8條譜帶，菌株CICC 21484出現(xiàn)5條譜帶。DGGE圖譜中，5株副溶血性弧菌的譜帶位置與3株沙門氏菌譜帶位置約處于同一水平線上。而5株單增李斯特菌的譜帶位置一致，且位于其它兩種菌的譜帶上方。

圖2 三種食源性致病菌的V3-PCR-DGGE指紋圖譜

2.3 ERIC-PCR指紋圖譜的構(gòu)建及分析

13株食源性致病菌經(jīng)ERIC-PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖3）表明，得到了譜帶豐富，分辨率較好的DNA指紋圖譜。5株副溶血性弧菌的譜帶最為豐富，為9-12條。5株單增李斯特菌譜帶數(shù)為4-7條。3株沙門氏菌譜帶數(shù)為7-10條。種間比較，3種食源性致病菌的指紋圖譜之間差距大。種內(nèi)比較，5株副溶血性弧菌的指紋圖譜之間差別不明顯，而5株單增李斯特菌和3株沙門氏菌的指紋圖譜間差別較顯著。

圖3 三種食源性致病菌的ERIC-PCR指紋圖譜

2.4 rpoB-DGGE、V3-DGGE和ERIC-PCR指紋圖譜聚類分析

運(yùn)用PAST ver. 1.79軟件對上述3種方法的指紋圖譜（圖1-F、圖2、圖3）進(jìn)行聚類分析（圖4），凡相似度大于80%者為同一基因型，小于80%者為不同的基因型［18］。如圖4-A所示，13株食源性致病菌可被rpoB-PCR-DGGE至少分為8個基因類型，菌株2、3、4、5為同一型，菌株8、9為同一型，菌株11、12為同一型，其他菌株各為不同型。使用Hunter和Gaston的方法計算出此分型方法的分辨力指數(shù)為0.90。圖4-B顯示，13株食源性致病菌可被V3-PCR-DGGE至少分為6個型，菌株1、2、4、5為同一型，菌株6、7、8、9、10為同一型，其它菌株各為不同型。此分型方法的分辨力指數(shù)為0.80。圖4-C顯示，13株食源性致病菌可被ERIC-PCR至少分為8個型，菌株1、2、3、4、5為同一型，菌株8、10為同一型，菌株11、13為同一型，其他菌株各為不同型。此分型方法的分辨力指數(shù)為0.90。

3 討論

3.1 不同GC夾及相同GC夾的不同引物連接位置對rpoB-PCR-DGGE的影響

本研究采用3種不同的GC夾（GC-1、GC-2、GC-3），并且將同種GC夾分別連接在正反引物上，共合成6對rpoB引物。針對3種（13株）食源性致病菌進(jìn)行rpoB-PCR-DGGE分析，獲得6張DGGE指紋圖譜。Rettedal等［20］研究表明GC夾中序列的變化，會引起GC%和Tm的變化，從而引起PCR結(jié)果的改變。本研究中，GC-1與GC-2的序列存在16個堿基的差異，GC-1和GC-3存在15個堿基的差異。最終獲得的DGGE圖譜間都存在一定的差異。Sheffield等［12］報道稱堿基序列中存在多個毗連的鳥嘌呤（G）會影響DNA序列合成或是PCR反應(yīng)的結(jié)果。Murphy等［21］研究表明多個相鄰的鳥嘌呤（G）易導(dǎo)致形成畸形的空間結(jié)構(gòu)，而且該結(jié)構(gòu)能抑制DNA聚合酶η的作用。GC-1中存在2次兩個連續(xù)，2次三個連續(xù)和1次四個連續(xù)的堿基G；GC-2中只存在1次兩個連續(xù)的堿基G；而GC-3中則不存在連續(xù)的堿基G。因此，圖1-F顯示DGGE的分型效果最好與上述具有一定的相關(guān)性。另外，相同的GC夾子分別連接在正反引物上，同樣對rpoB-PCRDGGE圖譜產(chǎn)生了一定的影響，如連接于正引物上沙門氏菌譜帶彌散，而連接于反引物上沙門氏菌譜帶正常且使菌株CICC 21484與其它兩株沙門氏菌區(qū)分開。近來，并未有相關(guān)研究對此現(xiàn)象進(jìn)行解釋。但可能仍與序列中存在多個連續(xù)的鳥嘌呤有關(guān)。因?yàn)檎飏poB（1698 f）中出現(xiàn)1次兩個連續(xù)的G，而反引物rpoB（2041 r）則未出現(xiàn)，分別與GC夾連接后進(jìn)行PCR而產(chǎn)生不同的反應(yīng)結(jié)果。本研究中，基于GC-3連接在ropB基因反引物上的DGGE圖譜的分辨效果最佳（圖1-F），因此在選擇或設(shè)計GC夾時，應(yīng)當(dāng)避免序列中出現(xiàn)連續(xù)的鳥嘌呤（G）以及連接于反引物的5'端。

圖4 三種食源性致病菌的三種分型方法指紋圖譜聚類分析

3.2 rpoB-PCR-DGGE與V3-PCR-DGGE結(jié)果比較分析

PCR-DGGE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性的研究，該技術(shù)?；?6S rDNA中保守區(qū)域片段，如V1-V3區(qū)［22］、V3區(qū)［23］、V6-V8區(qū)［24］。近年來，PCR-DGGE也被應(yīng)用于食源性致病菌的檢測與分型［25］。但根據(jù)文獻(xiàn)［26］報道，單一菌的16S rDNA存在多拷貝或異源雙鏈，導(dǎo)致DGGE圖譜中單一菌出現(xiàn)多條譜帶，從而使得微生物群落多樣性的結(jié)果評價過高或者檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了V3-PCR-DGGE對13株食源性致病菌進(jìn)行分型研究。結(jié)果（圖2）表明，4株副溶血性弧菌和2株沙門氏菌在DGGE圖譜中均出現(xiàn)了多譜帶現(xiàn)象。而5株單增李斯特菌均只有單譜帶出現(xiàn)。對于多譜帶的單一菌，基于16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE具有重復(fù)性好的特點(diǎn)，不同菌株譜帶數(shù)目與位置具有特異性。因此，該方法可針對性作為一種潛在的分型方法。但對于副溶血性弧菌與沙門氏菌的混合樣品，可能無法將二者同時準(zhǔn)確檢測出。

編碼RNA聚合酶β亞基基因（rpoB）是一種單拷貝的管家基因，與DGGE技術(shù)相結(jié)合，逐漸被應(yīng)用于微生物群落多樣性的研究中［27］。因此，基于rpoB的PCR-DGGE圖譜中，一種菌只有單譜帶，比基于16S rDNA的PCR-DGGE更為準(zhǔn)確地反映微生物群落多樣性。然而，未見有文獻(xiàn)報道關(guān)于rpoBPCR-DGGE技術(shù)對食源性致病菌進(jìn)行快速分型的研究。本研究應(yīng)用rpoB-PCR-DGGE技術(shù)對13株食源性致病菌進(jìn)行檢測與分型，同時與V3-PCR-DGGE的結(jié)果進(jìn)行比較。從本研究的圖譜（圖1-F，圖2）與圖譜聚類分析結(jié)果（圖4-A，4-B）明顯看出，rpoBPCR-DGGE檢測和分型的效果優(yōu)于V3-PCR-DGGE?；趓poB的DGGE圖譜中，13種菌各均只有單譜帶。與此同時，副溶血性弧菌、單增李斯特菌及沙門氏菌的譜帶都能較好地被區(qū)分開，同種菌的不同亞種也被不同程度的區(qū)分。根據(jù)Hunter和Gaston的分辨力指數(shù)計算方法可知，rpoB-PCR-DGGE分辨力（0.90）高于V3-PCR-DGGE分辨力（0.80）。

3.3 rpoB-PCR-DGGE與ERIC-PCR分子分型結(jié)果比較與分析

研究發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌中ERIC序列是一段長126 bp的反向重復(fù)序列，位于基因組內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域或與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域［28］。ERIC序列分布于整個基因組中，具有極強(qiáng)的保守性，用ERIC-PCR得到的DNA譜帶特征能反映出細(xì)菌整個基因組結(jié)構(gòu)的差異能區(qū)別包含有ERIC序列的不同細(xì)菌的種和株，因此具有很強(qiáng)的鑒別種乃至菌株的能力［29］。與其它分子分型方法相比，ERIC-PCR具有操作簡單，結(jié)果重復(fù)性好，分辨力強(qiáng)的優(yōu)勢。本研究中，同樣應(yīng)用了ERIC-PCR對13株食源性致病菌進(jìn)行了分型的研究，并與rpoB-PCR-DGGE的結(jié)果進(jìn)行比較。對圖譜結(jié)果（圖1-F，圖3）和圖譜聚類分析結(jié)果（圖4-A，4-C）分析可知，ERIC-PCR圖譜中每株菌的譜帶呈現(xiàn)出不同的多態(tài)性，副溶血性弧菌譜帶數(shù)最多，沙門氏菌次之，單增李斯特菌最少。ERIC-PCR的分辨力指數(shù)為0.9，與rpoB-PCR-DGGE分辨力相同。以上結(jié)果說明與ERIC-PCR相比，rpoB-PCR-DGGE同樣具有操作簡單，結(jié)果重復(fù)性好，分辨力強(qiáng)的特點(diǎn)。并且，對于實(shí)際樣品，后者能直接進(jìn)行快速檢測與分型，而前者需要先分離出單一菌株。

4 結(jié)論

不同序列的GC夾以及GC夾不同的引物連接位置均會對13株食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE檢測與分型結(jié)果產(chǎn)生影響，其分辨力與ERIC-PCR的相等并優(yōu)于V3-PCR-DGGE。因此，本研究得到了基于特定GC夾以及GC夾連接引物特定位置的rpoBPCR-DGGE能有效提高食源性致病菌進(jìn)行快速檢測與分型效果的結(jié)論，從而為提高食品安全質(zhì)量起到積極的促進(jìn)作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of GC Clamps on RpoB-PCR-DGGE Fingerprint of Three Types of Food Borne Pathogens

LIAO Chao1，2ZHANG Zhao-huan1，2YAO Xin1，2XIE Jing1ZHANG Wei-jia1，2，3PAN Ying-jie1，2，3ZHAO Yong1，2，3
（1. College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Laboratory of Quality ＆ Safety Risk Assessment for Aquatic Production on Storage and Preservation，Ministry of Agriculture，Shanghai 201306；3. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing ＆ Preservation，Shanghai 201306）

This work is to investigate the effect of different GC clamps and different positions of primers connected with GC clamps on the DGGE fingerprint of food borne pathogens. We synthesized 6 pairs of primers encoding RNA polymerase β subunit（rpoB 1-6）containing 3 different GC clamps（GC-1，GC-2 and GC-3）that linked to 5'endings of both forward and reverse primers，respectively. Then，rpoB-PCRDGGE was used to analyze Vibrio parahaemolyticus（5 strains），Listeria monocytogenes（5 strains），and Salmonella spp.（3 strains）. The results of fingerprint analysis were compared with that of V3-PCR-DGGE and ERIC-PCR. GC-3 clamp linked with reverse primer presented the best discriminating effect，and the discriminating index of rpoB-PCR-DGGE reached 0.9 that was equal to ERIC-PCR and greater than V3-PCR-DGGE. In conclusion，both of the different GC clamp sequences and linked positions of primers with GC clamp affected the result of rpoBPCR-DGGE fingerprint. Choosing or designing GC clamp without continuous guanine（G base）and linked with 5'ending of reverse primer will improve the detecting and typing effect of rpoB-PCR-DGGE for food borne pathogens.

Vibrio parahemolyticus；Listeria monocytogenes；Salmonella spp.；GC clamps；rpoB-PCR-DGGE

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.028

2015-07-22

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271870），上海市科委科技創(chuàng)新行動計劃項(xiàng)目（14DZ1205100，14320502100），上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字2014第3-5號、2005第4-8號），上海市水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心（11DZ2280300）

廖超，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物風(fēng)險評估；E-mail：liaochao2499@126.com

趙勇，男，教授，博士，研究方向：食品微生物風(fēng)險評估；E-mail：yzhao@shou.edu.cn