程序性細(xì)胞死亡在肝臟缺血-再灌注損傷中的作用研究進(jìn)展

白楊 史冀華 張水軍

原發(fā)性肝癌、肝硬化等嚴(yán)重威脅著人民的生命健康，肝移植是目前治療這些嚴(yán)重肝病的重要手段。在肝移植過程中，不可避免地會發(fā)生肝組織缺血，缺血肝組織在重新獲得血流灌注及氧供后，細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)不能及時恢復(fù)，反而較缺血時加重，導(dǎo)致細(xì)胞死亡、組織壞死、器官進(jìn)一步惡化的綜合征，稱為肝臟缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI），嚴(yán)重制約肝移植的臨床治療效果。

根據(jù)發(fā)生階段和原因的不同，HIRI可分為熱缺血損傷和冷缺血損傷。熱缺血損傷一般發(fā)生在肝切除、心臟死亡供者供肝肝移植以及肝缺血性休克期間，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷為主，可導(dǎo)致肝臟甚至多器官衰竭[1]。冷缺血損傷常發(fā)生在供肝冷保存階段，常見于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷和微循環(huán)障礙[2]。

HIRI的病理生理過程復(fù)雜，發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為HIRI與鈣超載、氧化應(yīng)激損傷、酸中毒、內(nèi)毒素?fù)p傷、補(bǔ)體激活等機(jī)制相關(guān)[3]。當(dāng)前認(rèn)為在熱缺血損傷中，缺血、缺氧會直接導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷。在冷缺血損傷中，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是HIRI的始動因素，可引起肝臟枯否細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞浸潤、血小板激活、細(xì)胞因子釋放，觸發(fā)局部無菌炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管持續(xù)收縮、微循環(huán)障礙，甚至肝功能障礙[4]。程序性細(xì)胞死亡是一種依賴于特定分子機(jī)制的細(xì)胞死亡形式，可以被藥物或基因調(diào)控，包括細(xì)胞凋亡、鐵死亡、壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PARP）-1依賴性細(xì)胞死亡等，現(xiàn)已成為HIRI的研究熱點(diǎn)，本文就肝臟缺血-再灌注過程中程序性細(xì)胞死亡方式的研究進(jìn)展予以綜述。

1 細(xì)胞凋亡

1972年，Kerr等[5]首先提出了細(xì)胞凋亡的概念，用來描述一種形態(tài)上與細(xì)胞壞死截然不同的細(xì)胞死亡形式。其主要的形態(tài)學(xué)特征為細(xì)胞體積縮小，連接消失，細(xì)胞質(zhì)密度增加；線粒體膜電位消失，通透性改變；核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為180～200 bp的片段；胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻，形成胞膜結(jié)構(gòu)完整的凋亡小體。根據(jù)起始階段啟動途徑的不同，凋亡可分為內(nèi)源性細(xì)胞凋亡和外源性細(xì)胞凋亡[6-7]。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境改變引發(fā)的一種程序性細(xì)胞死亡形式，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、DNA損傷、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）超載、有絲分裂缺陷或者微管改變等[6,8]。細(xì)胞微環(huán)境異常引發(fā)的刺激導(dǎo)致線粒體外膜上B細(xì)胞淋巴瘤（B cell-lymphoma，Bcl）-2基因家族促凋亡蛋白的寡聚化，形成蛋白脂質(zhì)孔道，增加線粒體外膜通透性，導(dǎo)致促凋亡因子從線粒體膜間隙釋放到胞漿中，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3、6、7、9的活化?；罨腃aspase進(jìn)一步導(dǎo)致DNA片段化、磷脂酰絲氨酸暴露和凋亡小體的形成，引發(fā)細(xì)胞凋亡。外源性細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞膜受體檢測到的細(xì)胞外微環(huán)境的異常所引發(fā)的細(xì)胞凋亡，通常由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族成員觸發(fā)，包括TNF本身、人凋亡相關(guān)因子配體（FasL）和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）等[9]。死亡受體與配體結(jié)合后募集銜接蛋白和起始蛋白原，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，進(jìn)而激活Caspase，引發(fā)下游級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-8和Caspase-10也可以在復(fù)合體內(nèi)自我激活，并直接激活Caspase-3，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA降解和細(xì)胞凋亡[10]。

細(xì)胞凋亡是目前HIRI過程中研究最多的細(xì)胞死亡方式，HIRI會促進(jìn)凋亡，使肝細(xì)胞再生受阻，最終導(dǎo)致原發(fā)性肝衰竭和移植后移植物長期功能障礙。研究表明，缺血階段損傷主要表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，再灌注階段損傷主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，并與缺血時間、程度和再灌注情況有關(guān)[11]。在冷缺血期間，凋亡主要發(fā)生在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在熱缺血和再灌注后，實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞均可發(fā)生細(xì)胞凋亡。HIRI時，細(xì)胞凋亡是一個不斷發(fā)生的動態(tài)過程，細(xì)胞表面分子受到誘導(dǎo)因子刺激后將信號傳入細(xì)胞，形成級聯(lián)式信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過啟動其自身內(nèi)部的基因表達(dá)，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

研究發(fā)現(xiàn)抑制凋亡可達(dá)到保護(hù)肝功能的目的。Caspase-3的激活是凋亡細(xì)胞DNA降解的前提，Cursio[12]發(fā)現(xiàn)抑制這些蛋白水解酶的激活可明顯減輕HIRI。加入外源性環(huán)磷酸腺苷可以明顯減少肝細(xì)胞凋亡[13]，應(yīng)用超氧物歧化酶等抗氧化劑也可減少自由基的產(chǎn)生，顯著減少細(xì)胞凋亡[14]。對于凋亡相關(guān)基因的干擾抑制同樣能達(dá)到減輕HIRI的目的。其它如一氧化氮等在肝移植過程中對肝臟也起到了一定的保護(hù)作用。

2 自噬及自噬依賴性細(xì)胞死亡

1963年，de Duve[15]首次提出并描述了細(xì)胞自噬現(xiàn)象。1992年，Takeshige等[16]利用酵母突變體確定了參與自噬過程的基因，奠定和推進(jìn)了自噬的研究進(jìn)展。自噬是一種受調(diào)控的細(xì)胞分解代謝過程[17]，負(fù)責(zé)在生物合成過程中清除長壽蛋白、受損細(xì)胞器和畸形蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和能量平衡[18]。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同，自噬分為宏自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬。在自噬過程中，由雙層膜囊泡構(gòu)成的自噬小體可吞噬細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解吞噬內(nèi)容物質(zhì)[19]。自噬通過對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解和再循環(huán)，維持了細(xì)胞自身的新陳代謝，對細(xì)胞存活和恢復(fù)內(nèi)部穩(wěn)態(tài)起到了重要作用[20]。自噬依賴性細(xì)胞死亡是一種受調(diào)控的細(xì)胞死亡方式，僅取決于自噬機(jī)制，需要通過相關(guān)手段抑制自噬可阻止細(xì)胞死亡來確認(rèn)，同時需排除凋亡、壞死等細(xì)胞死亡機(jī)制。自噬依賴性細(xì)胞死亡方式的標(biāo)準(zhǔn)過于嚴(yán)格，目前相關(guān)報道較少。

在正常肝臟中，自噬維持在一個較低水平，以維持肝臟的穩(wěn)態(tài)。大部分研究發(fā)現(xiàn)肝臟缺血-再灌注后，自噬水平增加[21-23]。HIRI可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路和腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）通路，通過Beclin-1通路激活自噬，肝臟通過自噬降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，維持能量水平并且清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，促進(jìn)肝細(xì)胞存活。而在嚴(yán)重的肝臟缺血性損傷期間，過度的自噬可能會破壞必需的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[24]。然而，自噬在HIRI的作用尚存在很大爭議[25]，缺血-再灌注后肝臟的自噬水平增加還是減少以及自噬對肝臟起保護(hù)還是損傷作用仍有待闡明。關(guān)于HIRI中自噬的研究結(jié)果存在差異可能與自噬評價方法不同、缺乏特異性的自噬激動劑或抑制劑等有關(guān)。

研究顯示，減少自噬可以有效減輕HIRI。在供肝冷保存液中加入自噬抑制劑渥曼青霉素和PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002抑制自噬小體的形成和成熟，可以緩解肝功能障礙和降低受體病死率[24]。使用常溫機(jī)械灌注的供肝，可以減少肝細(xì)胞自噬的水平，增加三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成，提高供肝質(zhì)量[26]。

3 鐵死亡

2012年，Dixon等[27]在研究Erastin通過RAS基因突變誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制時發(fā)現(xiàn)一種鐵離子介導(dǎo)的新型細(xì)胞程序性死亡方式，并根據(jù)其特征將這種特殊的細(xì)胞死亡方式稱為鐵死亡。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鐵超載及脂質(zhì)過氧化，胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）4活性降低，脂質(zhì)過氧化物不能被還原反應(yīng)代謝，從而積聚在胞內(nèi)，引起線粒體明顯萎縮，膜密度增加，線粒體嵴減少伴有嵴丟失和外膜破裂，導(dǎo)致鐵死亡[28]。

鐵死亡參與了HIRI病理生理過程[29]。HIRI可上調(diào)鐵死亡標(biāo)志物環(huán)加氧酶和脂質(zhì)過氧化水平。鐵超載是HIRI的一個新的危險因素，在小鼠模型中，高鐵飲食增加機(jī)體鐵負(fù)荷，可以加重HIRI[29]。鐵死亡主要涉及鐵穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)過氧化代謝的遺傳改變，但具體調(diào)控機(jī)制及其與其他細(xì)胞死亡方式是否具有協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)抑制鐵死亡可以減輕HIRI。Yamada等[29]發(fā)現(xiàn)鐵死亡特異性抑制劑鐵抑制素-1、Liproxstatin-1和α-生育酚可明顯減輕肝臟炎癥反應(yīng)，通過去鐵胺的鐵螯合作用也可以減輕HIRI。目前研究表明鐵死亡參與了HIRI，調(diào)控鐵死亡可干預(yù)HIRI，因此明確鐵死亡具體機(jī)制及下游調(diào)控機(jī)制，有望為HIRI的治療提供新的研究思路和治療策略。

4 壞死性凋亡

2005年，Degterev等[30]提出了壞死性凋亡的概念，用來描述一種在細(xì)胞凋亡受抑制的情況下，激活死亡受體依然能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的新型細(xì)胞死亡形式。壞死性凋亡可通過多種不同的死亡受體激活，包括TNF受體（TNF receptor，TNFR）1、人凋亡相關(guān)因子配體受體（Fas）、Z-DNA結(jié)合蛋白（Z-DNA binding protein，ZBP）1或病原體識別受體等[31]。死亡受體激活是否誘導(dǎo)凋亡或壞死性凋亡取決于受體相互作用蛋白激酶（receptor interacting protein kinase，RIPK）1和RIPK3。Caspase-8激活后裂解RIPK1和RIPK3，逆轉(zhuǎn)平衡導(dǎo)致凋亡，Caspase-8受到抑制后將導(dǎo)致RIPK1/RIPK3復(fù)合物的組裝，形成壞死小體，壞死小體催化混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶（mixed lineage kinase domain-like pseudokinase，MLKL） 磷酸化，導(dǎo)致MLKL聚合物形成后轉(zhuǎn)移到胞膜，使胞膜分解，增加胞膜通透性，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器普遍腫脹，細(xì)胞內(nèi)容物被釋放到微環(huán)境中，導(dǎo)致壞死性凋亡。

研究表明，在HIRI的病理生理過程中，特別是冷缺血階段，會導(dǎo)致壞死性凋亡的發(fā)生。Zhong等[32]發(fā)現(xiàn)，HIRI后RIPK3和MLKL表達(dá)水平顯著上調(diào)，且老齡小鼠壞死性凋亡比年輕小鼠更明顯。Lin等[33]發(fā)現(xiàn)喂食高脂肪食物的小鼠在HIRI后顯示出RIPK3和MLKL表達(dá)增加，表明脂肪變性的肝臟更容易發(fā)生壞死性凋亡。

研究表明，在HIRI情況下，壞死性凋亡特異性抑制劑Nec-1可有效抑制ROS的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，且與發(fā)生肝臟脂肪變性的野生型小鼠相比，特異性敲除MLKL小鼠的肝臟損傷程度更輕[34]。臨床有大量因脂肪變性而廢棄的供肝，壞死性凋亡的轉(zhuǎn)化研究可能有助于減輕脂肪變性肝臟的損傷程度，使這些邊緣供肝成為潛在的候選移植物。

5 細(xì)胞焦亡

2001年，Brennan等[35]提出了細(xì)胞焦亡的概念，用來描述一種由Caspase-1激活介導(dǎo)的依賴于焦孔素（Gasdermin D，GSDMD）蛋白家族成員的新型程序性細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞焦亡在形態(tài)學(xué)上兼具壞死和凋亡的特征。根據(jù)啟動途徑的不同，細(xì)胞焦亡可分為Caspase-1依賴的經(jīng)典途徑和Caspase-4、5、11依賴的非經(jīng)典途徑[36]。當(dāng)細(xì)胞受到外界各種刺激時，可以迅速識別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，從而激活胞內(nèi)Caspase-1的活性，啟動細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑。在以革蘭陰性菌表面脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為代表的各種感染因素的刺激下，LPS可以胞吞形式進(jìn)入細(xì)胞與Caspase-4、5、11前體特異性結(jié)合并將其活化，啟動細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑?；罨腃aspase進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)DNA斷裂，同時Caspase激活后裂解GSDMD，裂解后的GSDMD片段會直接誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔、破裂?；罨腃aspase還通過剪切白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18前體，形成具有活性的IL-1β和IL-18，并通過穿孔破碎的細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外引發(fā)局部和全身炎癥反應(yīng)[37]。研究表明，Caspases引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是調(diào)控細(xì)胞死亡或炎癥的中心環(huán)節(jié)[38]。

研究表明，HIRI可激活Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑，活化的Caspase-1在再灌注后1 h表達(dá)增多，并一直持續(xù)至再灌注后6 h，激活炎癥反應(yīng)通路[39]。HIRI還會激活Caspase-11依賴的細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑。再灌注時，腸道內(nèi)革蘭陰性菌可隨血液由肝門移位入肝釋放LPS，激活枯否細(xì)胞的胞內(nèi)因子核因子（nuclear factor，NF）-κB，促進(jìn)Caspase-11的轉(zhuǎn)錄與翻譯；另一方面，LPS以胞吞形式進(jìn)入枯否細(xì)胞，與Caspase-11在胞內(nèi)結(jié)合，并將其活化，啟動細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑[40]。

抑制細(xì)胞焦亡可以有效減輕肝臟炎癥反應(yīng)。Hua等[41]研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD基因敲除可保護(hù)枯否細(xì)胞免受HIRI誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。在小鼠HIRI模型中也證實(shí)抑制Caspase-1、11可減少IL-1β和IL-18釋放，減輕HIRI。先天免疫細(xì)胞的焦亡加重了HIRI，針對焦亡通路的靶點(diǎn)研究可能為臨床提供新的治療策略。

6 PARP-1依賴性細(xì)胞死亡

2009年，David等[42]在腦細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種依賴PARP-1的細(xì)胞死亡方式，并命名為Parthanatos，即PARP-1依賴性細(xì)胞死亡。在形態(tài)學(xué)上，PARP-1依賴性細(xì)胞死亡兼具有細(xì)胞凋亡和壞死的一些特征。環(huán)境變化或DNA損傷引起的PARP-1過度激活后會造成多聚二磷酸腺苷核糖（poly adenosine-diphosphateribose，PAR）產(chǎn)物的聚集，導(dǎo)致線粒體通透性的增加，引起凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）從線粒體釋放并攜帶巨噬細(xì)胞遷移抑制因子進(jìn)入細(xì)胞核，最終剪切染色體DNA，產(chǎn)生15～50 kb的DNA片段，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[43]。Caspase在PARP-1依賴性細(xì)胞死亡過程中被激活，且Caspase抑制劑并不能阻止這個過程，但PARP抑制劑及沉默或敲除PARP-1可有效阻止。

研究表明HIRI可以激活PARP-1依賴性細(xì)胞死亡通路。PARP-1是肝臟炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，HIRI可顯著誘導(dǎo)PARP-1上調(diào)并募集中性粒細(xì)胞至肝臟，促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生[44]。但目前PARP-1依賴性細(xì)胞死亡的調(diào)控機(jī)制以及下游機(jī)制尚不明確，PARP-1激活是如何誘導(dǎo)線粒體釋放AIF尚不清楚。抑制PARP-1依賴性細(xì)胞死亡可減輕HIRI。應(yīng)用PARP-1抑制劑5-氨基異喹啉酮可減少中性粒細(xì)胞浸潤，減少血管細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，保存內(nèi)皮完整性；特異性敲除PARP-1可使肝臟免受LPS誘導(dǎo)的休克及缺血性損傷[44]。明確PARP-1依賴性細(xì)胞死亡具體機(jī)制及上游調(diào)控機(jī)制，將會為HIRI提供新的研究思路和治療策略。

7 結(jié) 語

HIRI是影響患者肝臟外科手術(shù)后肝功能及生存率的重要因素，程序性細(xì)胞死亡是HIRI的重要特征之一，新型細(xì)胞死亡形式的發(fā)現(xiàn)極大地提高了我們對于HIRI病理生理學(xué)的理解。在缺血-再灌注期間，程序性細(xì)胞死亡可以呈現(xiàn)出不同的作用，不同的細(xì)胞死亡方式在HIRI中相互調(diào)控的關(guān)系需要進(jìn)一步探索。溶酶體細(xì)胞死亡、NETotic cell death、Entotic cell death等新型細(xì)胞死亡形式在HIRI中的作用也尚未見報道，亟待進(jìn)一步的研究?，F(xiàn)今各種細(xì)胞死亡的抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，然而使用時仍需解決許多問題。但是隨著研究的不斷深入，各種類型的細(xì)胞死亡的抑制劑可能會進(jìn)一步發(fā)展，并普及運(yùn)用到臨床當(dāng)中，減少HIRI，提高肝移植成功率，改善受者預(yù)后。