臨床異種器官移植十大問題的思考

竇科峰 張玄

20世紀初，由于人們對移植排斥反應的認知不足，以及缺乏有效的免疫抑制劑，關(guān)于異種器官移植的嘗試均以失敗告終[1]。直到1964年，美國Keith Reemtsma給1例腎衰竭患者移植了黑猩猩的腎臟，并給予硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)激素、全身照射等免疫抑制治療，患者術(shù)后順利康復并重返教師崗位，最終存活9個月，死于突發(fā)的電解質(zhì)紊亂[2]。1984年，美國Leonard Bailey為剛出生12 d，患左心發(fā)育不全綜合征的女嬰移植了1顆狒狒的心臟，術(shù)后患兒血液學檢查、超聲心動圖和免疫學監(jiān)測各項指標均正常，但術(shù)后11 d開始出現(xiàn)呼吸急促以及明顯心肌損傷，最終因移植排斥反應僅存活21 d[3]。1992年，美國Thomas Starzl將狒狒的肝臟移植給了1例急性暴發(fā)性肝衰竭患者，患者最終存活70 d后死于復合性感染[4]。此后的很長一段時間里，異種器官移植始終停留在以豬為供體的臨床前研究階段。

近年來，得益于基因編輯領(lǐng)域的技術(shù)突破和新型共刺激信號阻斷免疫抑制劑的研發(fā)，異種器官移植領(lǐng)域取得了許多突破性進展[5]。2018年，德國Reichart團隊完成了異種原位心臟移植臨床前試驗，受體狒狒存活195 d[6]。2019年，美國Kim等[7]實施豬至恒河猴的原位腎移植，受體猴最長存活499 d。2021年，異種腎移植進入亞臨床試驗階段，美國Montgomery團隊將豬腎移植給了1例腦死亡患者，術(shù)后移植腎功能良好，沒有出現(xiàn)排斥反應[8]。2022年，美國Griffith團隊成功將基因編輯豬的心臟原位移植給了1例57歲心力衰竭患者，完成了世界首例基因編輯豬到人的心臟移植[9]。這一系列具有里程碑意義的科學事件，為異種器官移植的臨床應用帶來了希望。那么對于臨床異種器官移植，有哪些問題需要我們重點關(guān)注，并進一步去攻克呢？

1 臨床異種器官移植需克服排斥反應

異種器官移植排斥反應包括：（1） 超急性排斥反應，由豬內(nèi)皮細胞表面α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose，αGal）抗原與靈長類動物體內(nèi)預存抗體結(jié)合而誘發(fā)，導致補體系統(tǒng)激活，形成膜攻擊復合物，隨著2002年α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除豬的問世，超急性排斥反應已經(jīng)在很大程度上得到解決；（2）急性血管性排斥反應，由非αGal抗原（如Neu5Gc、Sda）與靈長類動物體內(nèi)抗體結(jié)合，引起移植物血管內(nèi)皮活化和發(fā)生單核細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞參與的炎癥反應；（3）急性排斥反應，由CD4+T細胞、CD8+細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）參與的急性移植物血管炎和間質(zhì)炎；（4）慢性排斥反應，由循環(huán)中特異性抗體低水平的免疫應答導致血管周圍炎癥，導致移植物血管內(nèi)皮持續(xù)低程度的損害伴有血管平滑肌細胞增生阻塞血管，移植物功能逐漸下降。研究發(fā)現(xiàn)，盡管移植方案不同，但非人靈長類動物的同種腎移植1、3、12個月的生存率明顯高于異種腎移植，且病理學觀察發(fā)現(xiàn)，同種腎移植存在更多的細胞性排斥反應，而異種腎移植則表現(xiàn)出更多的體液性排斥反應[10]。異種器官移植現(xiàn)階段最難克服的是非αGal抗原參與的急性血管性排斥反應。有學者提出除了敲除3種主要異種抗原基因（αGal、Neu5Gc、Sda）以外，第4種未知異種抗原基因也需要被鑒定和敲除，以期進一步減少體液性排斥反應，改善移植物功能[11]。

2 臨床異種器官移植需控制炎癥反應

越來越多的證據(jù)表明，豬到非人靈長類動物器官移植后會存在持續(xù)的全身性炎癥反應狀態(tài)[12]。在移植受體血清中可檢測到C-反應蛋白、抗組蛋白抗體、血清淀粉樣蛋白A、D-二聚體、細胞因子、趨化因子等多種炎癥標志物增加，以及游離三碘甲狀腺原氨酸減少。盡管炎癥反應在異種器官移植中的作用目前尚不完全清楚，但研究表明，炎癥、凝血和免疫反應之間存在著復雜的相互作用[13]，炎癥反應可促進凝血途徑的激活和適應性免疫反應的發(fā)生[14-15]。C-反應蛋白被發(fā)現(xiàn)在消耗性凝血疾病或T細胞反應發(fā)展之前就會升高[14]。浸潤的固有免疫細胞表達組織因子，在啟動凝血過程中起重要作用[16]。炎癥反應還會抑制T細胞耐受的形成[13]。因此，要延長異種器官移植受體的存活時間，需采取更有效的抗炎策略，包括在基因編輯豬中轉(zhuǎn)入人源化抗炎基因，以及對移植受體給予一定劑量的抗炎藥物治療等。此外，炎癥反應的有效控制也可能幫助降低外源性免疫抑制治療的強度，減輕藥物不良反應。根據(jù)目前的臨床前研究結(jié)果，若要實現(xiàn)異種移植物的長期存活，炎癥反應的控制至關(guān)重要。

3 臨床異種器官移植需調(diào)節(jié)凝血紊亂

異種器官移植時，靜息態(tài)的內(nèi)皮細胞、單核細胞會暴露于炎癥分子而被激活，喪失抗凝和抗血小板能力，并且表達組織因子，而組織因子的暴露或釋放會啟動凝血級聯(lián)途徑，并經(jīng)炎癥、固有免疫反應途徑放大，此時凝血調(diào)節(jié)蛋白（如組織因子途徑抑制物、血栓調(diào)節(jié)素等）的種間分子不兼容，會導致其抗凝效應減弱。而血小板一旦接觸到血栓表面就會被激活，活化的血小板會分泌顆粒成分，暴露促凝血膜磷脂，從而加速凝血酶的產(chǎn)生。凝血紊亂最終會導致移植物內(nèi)血栓性微血管?。╰hrombotic microangiopathy，TMA），且移植受體伴隨發(fā)生系統(tǒng)性消耗性凝血病[17]。研究表明，不管移植物是否發(fā)生急性體液性排斥反應，凝血紊亂均可發(fā)生，這與非αGal抗原-抗體反應有關(guān)，且異種肝、肺移植后極易出現(xiàn)凝血紊亂，可在術(shù)后幾分鐘至數(shù)小時內(nèi)發(fā)生嚴重的血小板耗竭，加重凝血功能障礙，導致致死性出血，其病理嚴重程度會明顯高于心臟移植或腎移植[18]。

4 臨床異種器官移植需提高移植物生理相容性

除了免疫方面的不相容性，異種器官移植后還會存在生理功能是否相容的問題。對于原位心臟移植，在供體豬中敲除生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）是一種防止異種移植心臟過度生長的有效策略[19]。異種心臟移植臨床試驗中使用的供體豬就是在GGTA1-敲除（knock out，KO）/β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2（β-1，4-N-acetylg alactosaminyltransferase 2，β4GalNT2）-KO/ 單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）-KO的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了GHR基因敲除。在異種腎移植中，早期更多關(guān)注的是移植后蛋白尿問題，而最近的研究中均沒有觀察到蛋白尿現(xiàn)象，這表明它與免疫反應有關(guān)。研究表明，除了豬促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）和靈長類動物EPO受體之間可能存在的差異外，豬和靈長類動物的腎功能在臨床上沒有顯著的生理性不相容[20]。與心臟、腎移植相比，肝移植的情況更為復雜，豬肝產(chǎn)生的100多種蛋白質(zhì)可能不會在人體內(nèi)充分發(fā)揮作用?？茖W家已證實了原代人肝細胞和豬肝細胞在凝血蛋白表達和功能調(diào)節(jié)方面存在物種特異性差異[21]，因此，需要對供體豬進行更多的基因改造，使其能產(chǎn)生人類需要的功能蛋白。

5 臨床異種器官移植需重視種間感染風險

臨床異種器官移植中的供體豬需要在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）和（或）無指定病原體（designated pathogen free，DPF）的環(huán)境中培育和飼養(yǎng)，以降低細菌、病毒和寄生蟲等微生物的跨物種傳播風險[22]。盡管豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）是一種以前病毒DNA形式整合入豬基因組中的反轉(zhuǎn)錄病毒，只能通過基因編輯的手段清除[23]，但由全球異種移植領(lǐng)域?qū)＜夜餐鸩莸摹堕L沙宣言》明確闡明PERV實際傳播的風險不僅很小并且可控[24]。科學研究表明，嗜人重組PERV-A/C原病毒只能在極少數(shù)的小型豬中發(fā)現(xiàn)，而在其他豬中卻沒有發(fā)現(xiàn)，即使應用高度敏感的293T細胞，將其分離為能夠在人類細胞上復制的傳染性病毒也極其罕見[25]。同時，我國科學家已成功篩選與鑒定出未經(jīng)CRISPR/Cas9處理的PERV pol基因缺陷小型豬[26]，有效避免了多種基因修飾對豬的健康生長造成的潛在威脅，且可大規(guī)模繁育，為批量生產(chǎn)符合安全標準的豬器官和組織提供了保障。

6 臨床異種器官移植需優(yōu)化免疫抑制方案

基因編輯可以縮小但不能完全消除供受體的種間差異，因此，一定程度的免疫抑制治療仍然是必需的[5]。研究表明，傳統(tǒng)以他克莫司為基礎(chǔ)的免疫抑制方案不足以有效克服異種免疫排斥反應，其在抑制適應性免疫反應方面效率較低。因此，在臨床前試驗中，一般會增加單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的使用，如采用抗CD154 mAb（aCD154 mAb）或aCD40 mAb去阻斷CD154/CD40共刺激通路，抑制抗原提呈細胞和T細胞活化[5]，同時，研究表明阻斷CD154/CD40共刺激通路的效果要優(yōu)于阻斷CD28/B7共刺激通路[27]。CD154被證實在活化的CD4+T細胞表面大量表達，而CD40由專職抗原提呈細胞表達，包括樹突狀細胞、單核吞噬細胞、B細胞以及CD8+T細胞。盡管現(xiàn)有的實驗已證實aCD40 mAb對于延長異種移植物存活的有效性[5]，但在預防早期移植物丟失方面，aCD154 mAb的治療效果可能會優(yōu)于aCD40 mAb[28]。 此 外，aCD4 mAb和 aCD8 mAb可有效清除靈長類動物受體的T細胞，顯著改善移植腎功能并延長受體存活時間[7]。在心臟移植過程中，aCD20 mAb則被用來清除B細胞，顯示出一定效果[6]。需要注意的是，異種器官移植的免疫抑制強度明顯高于同種器官移植，這也導致了因感染所致的移植物丟失和受體病死率明顯增加[10]。

7 臨床異種器官移植需篩選供體基因編輯類型

目前認為，對于供體豬的基因編輯并不是越多越好，過多的基因編輯不僅降低了供體豬的存活率，同時也增加了新的異種抗原暴露的機會[5]。盡管有學者認為，異種器官移植臨床前試驗中CMAH為非必要敲除基因，但對于臨床試驗而言，供體豬的GGTA1-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO是必需的，在此基礎(chǔ)上適當轉(zhuǎn)入人源化的補體抑制因子、凝血調(diào)節(jié)因子和抗炎抗吞噬因子會在一定程度上改善移植物功能。有學者提出，適合臨床應用的供體豬應該是“9-基因”編輯，即 GGTA1-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hTM/hEPCR/hHO-1/hCD47[29]。而異種心臟移植臨床試驗中所使用的供體豬為“10-基因”編輯，就是在此基礎(chǔ)上增加了針對心臟過度生長的GHR基因敲除[9]。

8 臨床異種器官移植需選擇適宜受者人群

對于異種器官移植臨床試驗，針對不同的移植器官類型有不同的適宜受者人群。腎移植適宜人群包括：（1）快速復發(fā)性腎病患者，如復發(fā)性的局灶性硬化性腎小球硬化癥、復發(fā)性IgA腎病、復發(fā)性Ⅱ型膜性增生性腎小球腎炎等；（2）對人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）高致敏患者；（3）血管通路缺失患者；（4）無明顯伴發(fā)疾病的老年患者[30]。心臟移植適宜人群包括：（1）二次心臟移植患者；（2）對HLA高致敏患者；（3）因解剖或病理性因素導致心室輔助裝置（ventricular assist device，VAD）無法植入患者；（4）限制性心肌病患者；（5）捐獻者和受者心臟大小不匹配患者。肝移植適宜人群包括：（1）急性暴發(fā)性肝衰竭患者；（2）同種肝移植發(fā)生肝動脈栓塞或原發(fā)性移植肝無功能患者；（3）慢性肝病中急性失代償期患者[30]。肺移植適宜人群包括：（1）需要長期體外膜肺氧合支持患者；（2）同種肺移植后發(fā)生慢性排斥反應患者（閉塞性細支氣管炎綜合征）；（3）需要接受肺和其他器官聯(lián)合移植患者[30]。

9 臨床異種器官移植需完善異種移植指南

在異種移植監(jiān)管層面，全球異種移植臨床研究規(guī)范國際研討會兩次在我國長沙召開，世界各國專家在廣泛和深入討論的基礎(chǔ)上，共同起草了針對世界 衛(wèi) 生 組 織（World Health Organization，WHO）所有成員國的臨床異種移植研究規(guī)范——《長沙宣言》[24]。美國食品與藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）為推進異種移植臨床試驗，多次修訂了《來源動物、產(chǎn)品、臨床前和臨床問題有關(guān)異種移植產(chǎn)品在人類使用》的行業(yè)指南。我國為推進異種移植臨床研究的安全、順利開展，規(guī)范異種移植臨床研究行為，根據(jù)相關(guān)法律和規(guī)范，中華醫(yī)學會器官移植學分會異種移植學組從總則、項目申請與審查、技術(shù)標準、倫理要求、生物安全、項目管理、追蹤隨訪等方面，初步制定了我國異種移植臨床研究指導意見[31]。

10 臨床異種器官移植需明確大眾認可度

不同宗教信仰的世界各國人民對于異種器官移植的接受程度明顯不同，但總體認可度尚可。猶太教并不反對異種器官移植延長和拯救人類生命，保護生命幾乎毫無例外地比其他價值觀更重要；基督教認為，只要人類的尊嚴和完整性得到保護，動物是根據(jù)公認的道德標準對待的，那么異種器官移植在促進人類健康方面就是合理的；伊斯蘭教提出非豬源性異種器官移植作為一種拯救生命的治療方式在一定條件下是被允許的[32]。調(diào)研顯示，美國公眾普遍認為異種器官移植是一種令人興奮且可接受的器官替代治療方法[33]。德國公民團體認為異種器官移植的好處大于風險，但呼吁采取嚴格的監(jiān)管措施，以確?？沙掷m(xù)和合乎倫理的生物技術(shù)發(fā)展[34]。英國和澳大利亞的研究顯示，很大一部分糖尿病患者可接受異種器官移植產(chǎn)品[35]。我國臺灣地區(qū)的被調(diào)查者亦認為發(fā)展異種器官移植很重要，異種器官移植對人類社會利大于弊[36]。

11 展 望

我國器官移植始于20世紀60年代，發(fā)展至今已是世界器官移植大國，僅次于美國。據(jù)統(tǒng)計，我國每年需要接受器官移植的患者超過30萬。自2015年1月實施公民自愿器官捐獻起，截止至2022年3月，共實現(xiàn)捐獻38 681例，捐獻器官116 092個，每年接受器官移植的患者僅有1萬余例。因此，在積極推行公民自愿器官捐獻的同時，我國亟需大力發(fā)展異種器官移植研究，以解決器官移植供需嚴重失衡的問題。2022年可謂是異種器官移植的新元年，當前我國正面臨著巨大的契機和挑戰(zhàn)，應繼續(xù)加強異種器官移植領(lǐng)域的技術(shù)攻關(guān)，重視異種器官移植理論認知水平的提升、新型免疫抑制劑的研發(fā)、DPF級大動物繁育設(shè)施的建設(shè)、臨床前研究經(jīng)驗的積累，以及相關(guān)法律法規(guī)的完善等，并加快搭建異種器官移植從基礎(chǔ)研究到臨床應用的橋梁，提升我國在異種器官移植領(lǐng)域的國際競爭力，以解決人類重大健康需求。