持續(xù)動態(tài)機械加壓誘導腰椎關節(jié)突關節(jié)源性腰痛大鼠模型的建立和觀察*

呂 游 王祖強 侯樹勛

（1 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心骨科，北京100048；2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心骨科，北京100048）

腰痛 (low back pain, LBP) 在全球范圍內(nèi)是最重要的健康問題之一，超過80%的成年人在一生之中會受到腰痛困擾，并導致日?；顒拥南拗坪蜕钯|(zhì)量的下降，而隨著全球老齡化的進展，腰痛的發(fā)生率還會逐年上升[1～4]。多項研究證實[5,6]，癥狀性退行性病變 (symptomatic degenerative defects, SDD) 是引起腰痛的最主要病因，而疼痛的來源可來自一個或多個結(jié)構，包括椎間盤、關節(jié)突關節(jié)、后方韌帶復合體、肌肉和筋膜組織等[7,8]。由椎間盤和兩側(cè)腰椎關節(jié)突關節(jié)組成的三關節(jié)復合體 (three-joint complex, TJC) 是腰椎十分重要的解剖結(jié)構和功能單元，而椎間盤退變和腰椎關節(jié)突關節(jié)骨關節(jié)炎同樣也是腰椎退行性改變最重要的病理基礎。病理動物模型的制備對于認識疾病的發(fā)病機制具有十分重要的作用，所以有必要制備腰痛動物模型來了解腰痛的發(fā)病機制。既往已有大量研究成功建立椎間盤源性腰痛動物模型[9]，對了解發(fā)病機制和探討治療方法起到重要作用，而關節(jié)突關節(jié)源性腰痛動物模型研究相對較少[10]，其中多數(shù)模型是借鑒椎間盤源性腰痛的制模方法，通過向關節(jié)突關節(jié)腔內(nèi)注射致炎物質(zhì)或針刺損傷關節(jié)突關節(jié)構建模型。腰椎關節(jié)突關節(jié)與椎間盤解剖結(jié)構和生理特點不同，引起腰痛的致病機制也差異很大，所以此類制模方法不能很好地模擬人體發(fā)病過程，因而十分有必要摸索發(fā)現(xiàn)新的關節(jié)突關節(jié)源性腰痛制模方法，以便更好地進行病因研究，并為后續(xù)的治療研究提供素材。本研究通過腰椎關節(jié)突關節(jié)持續(xù)動態(tài)機械加壓，構建腰椎關節(jié)突關節(jié)源性腰痛大鼠模型，借此探討腰椎關節(jié)突關節(jié)源性腰痛的發(fā)病機制。

方 法

1.特制加壓彈簧裝置的制備

根據(jù)成年大鼠腰椎解剖特點，設計專用棘突間加壓彈簧，作為關節(jié)突關節(jié)持續(xù)加壓裝置（見圖1）。彈簧由浙江溫州永興康力彈簧廠制造，采用316L不銹鋼材料制成，線徑0.4 mm。彈簧外徑2 mm，初始長度2 mm，掛耳長度2 mm。根據(jù)人體生物力學測定結(jié)果，人類腰椎關節(jié)突關節(jié)在直立狀態(tài)下承受的縱向壓力是人體體重的20%[11]。成年大鼠的體重為250 g，模擬人體直立狀態(tài)，關節(jié)突關節(jié)縱向受力應設定為50 g。大鼠在麻醉狀態(tài)下棘突間寬度為2 mm，腰椎后凸狀態(tài)下棘突間寬度可增加至4 mm。按此標準調(diào)整彈簧拉力并通過生物力學測試驗證，彈簧初始長度2 mm，當彈簧被拉長至4 mm 時，可提供50 g 拉力。

圖1 腰椎棘突間加壓彈簧專用裝置Fig. 1 A modified intraspinal compression spring

2. 實驗動物及分組

健康成年雄性SD 大鼠66 只，由解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心動物實驗中心提供，體重在250～300 g 之間。所有動物置于自然光照條件飼養(yǎng)室，室內(nèi)溫度維持在20～25℃，攝食、飲水、活動自由，專人定期清潔消毒。所有操作及動物處理均嚴格遵守相關動物保護及使用規(guī)定（倫理審批號：SYXK(京) 2017-0023）。

采用隨機數(shù)字表法將66 只大鼠隨機分為3 組：實驗組（30 只大鼠）、對照組（30 只大鼠）、空白組（6 只大鼠）。其中，實驗組和對照組再隨機分為5 個亞組，每組6 只，分別標記為3 天組、7天組、14 天組、28 天組、42 天組。空白組6 只大鼠不再分組。

3. 動物模型制備

本研究采取腰椎關節(jié)突關節(jié)持續(xù)動態(tài)機械加壓方法制備腰椎關節(jié)突關節(jié)源性腰痛大鼠模型。對于實驗組大鼠，對L5-6節(jié)段采用外科方法行腰椎關節(jié)突關節(jié)持續(xù)動態(tài)機械加壓干預措施，具體操作方法如下：以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（劑量為40 mg/kg），背部皮膚常規(guī)去毛備皮，碘伏消毒鋪巾。以L5棘突為中心取腰椎后正中切口，長約3 cm。剝離椎旁肌，顯露上位和下位棘突。在棘突上打孔，將特制彈簧固定于上位和下位棘突之間（見圖2），確定彈簧固定可靠后，逐層縫合切口。術后肌肉注射青霉素3 天預防感染。對照組大鼠，對L5-6節(jié)段行同一外科切口切開，顯露棘突后在棘突上打孔但不固定彈簧，然后關閉切口?？瞻捉M大鼠，不進行任何外科手術干預，在相同時間內(nèi)進行自然飼養(yǎng)。

圖2 特制加壓彈簧固定于大鼠腰椎棘突之間Fig. 2 The modified intraspinal compression springs was fixed between the two spinous processes of the lumbar vertebrae in rat

4. 觀測方法和測量指標

（1）機械刺激縮足反射閾值測量：分別于術前和術后3 天、7 天、14 天、28 天、42 天進行機械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)測量。通過系列壓力von Frey 纖毛機械刺激測試針（上海玉研科學儀器有限公司）測量MWT，以此反映實驗大鼠的機械痛覺超敏反應。測試前3 天，每日將大鼠單獨置于實驗觀察箱內(nèi)30 分鐘，使大鼠適應測量環(huán)境。測試環(huán)境為室溫22～26℃的安靜實驗室環(huán)境，測試時間為上午8 時至12 時。將大鼠置于均勻網(wǎng)格的鐵絲網(wǎng)蓋上，并以透明有機玻璃盒覆蓋。選取一套標準化系列壓力的von Frey 纖毛機械刺激針，從最小壓力值 (1.0 g) 的von Frey 纖毛機械刺激針開始，依次選取不同壓力的von Frey 纖毛機械刺激針從鐵絲網(wǎng)格底部由下向上，垂直刺向大鼠后肢足底中央部，使von Frey 纖毛機械刺激針彎曲變形，成為S 形，持續(xù)5～8 秒，觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足反應。如果大鼠在刺激時間內(nèi)或移開von Frey纖毛機械刺激針時出現(xiàn)快速縮足反應，則標記為陽性。在其他時間出現(xiàn)的縮足反應或非縮足樣反應，均標記為陰性。兩次測試的間隔時間至少為5 分鐘，當測試縮足反應由陽性轉(zhuǎn)為陰性后，采用上一級von Frey 纖毛機械刺激針再次進行測試。根據(jù)Dixon 等[12]推薦的方法，出現(xiàn)50% MWT（即測量10 次至少連續(xù)出現(xiàn)5 次縮足反應）的von Frey纖毛機械刺激針的壓力值，即為該大鼠的MWT閾值。

（2）熱縮足反射潛伏期測量：分別于術前和術后3 天、7 天、14 天、28 天、42 天進行熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)測量。通過使用BW-PLantar-400 熱刺激痛覺測試儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司），采用熱輻射法測量TWL，以此反映實驗大鼠的熱痛覺超敏反應。測試前3 天，每日將大鼠單獨置于實驗觀察箱內(nèi)30 分鐘，使大鼠適應測量環(huán)境。測試環(huán)境為室溫22～26℃的安靜實驗室環(huán)境，測試時間為上午8 時至12 時。將大鼠置于恒溫的有機玻璃板上，可在一定范圍內(nèi)自由活動，大鼠在測量環(huán)境中適應15 分鐘，使用BW-PLantar-400 熱刺激痛覺測試儀從有機玻璃板底面垂直照射大鼠后足中后部，此部位在大鼠靜立時與有機玻璃板緊密接觸。從熱測痛儀開始照射，至大鼠出現(xiàn)縮足反射，記錄時長。間隔10 分鐘進行重復測量3 次，取平均值，即為TWL。

（3）步態(tài)分析：分別于術前和術后3 天、7 天、14 天、28 天、42 天進行步態(tài)分析。借助于CatWalk XT 步態(tài)分析系統(tǒng) (noldus information technology)，通過計算機輔助分析，可以分析大鼠的步態(tài)特點，由此反映大鼠的疼痛行為學改變。進行正式實驗測試前，大鼠先期進行適應性測試訓練，在沒有食物、飲水、氣味等外部刺激和任何強迫措施的條件下，不停頓連續(xù)通過CatWalk 步行臺，從而獲取大鼠的自然步態(tài)。正式實驗時，每只大鼠至少記錄3 次順利通過步行臺的過程，每次至少記錄到10 個步態(tài)。所有步態(tài)細節(jié)由高速攝像機捕獲記錄并傳輸至計算機。本實驗采用CatWalk XT 10.6 步態(tài)分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理，獲取大量步態(tài)參數(shù)，選取以下4 個指標進行比較分析：足印面積 (print area)、支撐相 (stand phase)、擺動相(swing phase)、擺動速度 (swing speed)。

（4）滑膜炎性因子含量測定：分別于術后3 天、7 天、14 天、28 天、42 天各時間點，將實驗組和對照組完成以上疼痛行為學測量的大鼠，經(jīng)1.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉處死。對于實驗組大鼠，在處死前拍攝正側(cè)位X 光片，確認彈簧位置良好，無脫落。處死后外科顯露并于體視鏡下完整切取L5-6節(jié)段關節(jié)突關節(jié)滑膜?？瞻捉M完成所有時間點疼痛行為學測量的大鼠于術后42 天經(jīng)腹腔麻醉處死，外科顯露并于體視鏡下完整切取L5-6節(jié)段關節(jié)突關節(jié)滑膜。采用酶聯(lián)免疫吸附 (enzyme-linked immunosorbent assays, ELISAs) 的方法，對關節(jié)突關節(jié)滑膜中的腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 和白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β) 的含量進行測定。

（5）組織形態(tài)學觀察：將實驗組和對照組大鼠以上各時間點切取的腰椎L5-6節(jié)段組織標本置于4%多聚甲醛溶液中，固定48～72 小時后，用混合酸溶液脫鈣4～8 周，采用針刺法確定脫鈣終點。截取L5-6節(jié)段關節(jié)突關節(jié)，脫水后行石蠟包埋。采取垂直關節(jié)突關節(jié)間隙方向切片，行甲苯胺藍 (toluidine blue, TB) 染色，進行關節(jié)突關節(jié)組織形態(tài)學觀察。

5. 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)采取均數(shù)±標準差(±SD)表示，多組之間均數(shù)比較使用方差分析和多個均數(shù)之間兩兩比較的SNK-q 檢驗方法，兩組之間均數(shù)比較使用t 檢驗方法，P ＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.機械刺激縮足反射閾值測量

實驗組大鼠在處死前行全身正側(cè)位X 光片檢查，影像結(jié)果顯示所有實驗組大鼠體內(nèi)加壓彈簧均穩(wěn)定固定于加壓節(jié)段棘突之間，位置良好，未見任何脫落、移位現(xiàn)象（見圖3）。

圖3 X 光片檢查提示彈簧固定于棘突之間，未見彈簧脫落移位Fig. 3 Representative X-ray images confirming that the compression spring was fixed between the two spinous processes without dislocations

MWT 測量通過標準化的系列壓力von Frey 機械刺激測試針測定，測試時間分別為術前和術后3天、7 天、14 天、28 天、42 天，各組各時間點的測量結(jié)果見圖4。

圖4 各時間點機械刺激縮足反射閾值測量結(jié)果Fig. 4 Comparison of mechanical withdrawal thresholds in the three groups in diあerent time points

組間比較：手術前三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明手術前所有大鼠的MWT 處于同一基線。術后3 天，實驗組、對照組與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，而實驗組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義。術后7 天、術后14 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。術后28 天、術后42 天，三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

組內(nèi)比較：實驗組術后各時間點與術前MWT比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后3 天與術后7 天比較，差異無統(tǒng)計學意義，與術后14 天、28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后7 天與術后14 天、28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后14 天與術后28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后28天與術后42 天比較，差異無統(tǒng)計學意義。對照組術后3 天、7 天、14 天與術前MWT 比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，術后28 天、42 天與術前MWT 比較，差異無統(tǒng)計學意義?？瞻捉M術前與術后各時間點MWT 比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

2.熱縮足反射潛伏期測量

TWL 測量通過BW-PLantar-400 熱刺激痛覺測試儀測定，測試時間分別為術前和術后3 天、7 天、14天、28 天、42 天，各組各時間點的測量結(jié)果見圖5。

圖5 各時間點熱縮足反射潛伏期測量結(jié)果Fig. 5 Comparison of thermal withdrawal latencies in the three groups in diあerent time points

組間比較：手術前三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明手術前所有大鼠的TWL 處于同一基線。術后3 天，實驗組、對照組與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，實驗組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。術后7 天、術后14 天，28 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。術后42 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。

組內(nèi)比較：實驗組術后各時間點與術前TWL比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后3 天與術后14天比較，差異無統(tǒng)計學意義，與術后7天、28天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后7天與術后14 天、28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后14 天與術后28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后28 天與術后42天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。對照組術后3 天、7 天、14 天、28 天與術前TWL 比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，術后42 天與術前TWL比較，差異無統(tǒng)計學意義?？瞻捉M術前與術后各時間點TWL 比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

3. 步態(tài)分析

（1）足印面積 (print area)

組間比較：手術前三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明手術前所有大鼠的足印面積處于同一基線。術后3 天，實驗組、對照組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，實驗組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。術后7 天、術后14 天，28 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學意義。術后42 天，三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（見圖6）。

組內(nèi)比較：實驗組術后各時間點與術前足印面積比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后3 天與術后7 天、14 天、28 天、42 天比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后7 天與術后14 天、28 天、42 天比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后14 天與術后28 天、42 天比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后28 天與術后42 天比較，差異無統(tǒng)計學意義。對照組術后3 天、7 天與術前足印面積比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，術后14 天、28 天、42 天與術前足印面積比較，差異無統(tǒng)計學意義?？瞻捉M術前與術后各時間點足印面積比較，差異均無統(tǒng)計學意義（見圖6）。

圖6 各時間點足印面積測量結(jié)果Fig. 6 Comparison of print area in the three groups in diあerent time points

（2）支撐相 (stand phase)

組間比較：手術前三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明手術前所有大鼠的支撐相處于同一基線。術后3 天、7 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。術后14 天、28 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。術后42 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（見圖7）。

組內(nèi)比較：實驗組術后各時間點與術前支撐相比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后3 天與術后28 天比較，差異無統(tǒng)計學意義，與術后7 天、14 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后7 天與術后14 天、28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后14 天與術后28 天、42天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后28 天與術后42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。對照組術后7 天、14 天、28 天與術前支撐相比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，術后3 天、42 天與術前支撐相比較，差異無統(tǒng)計學意義。空白組術前與術后各時間點支撐相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（見圖7）。

圖7 各時間點支撐相測量結(jié)果Fig. 7 Comparison of stand phase in the three groups in diあerent time points

（3）擺動相 (swing phase)

組間比較：手術前三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明手術前所有大鼠的擺動相處于同一基線。術后3 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。術后7 天、14 天、28 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。術后42 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，對照組和空白組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（見圖8）。

組內(nèi)比較：實驗組術后各時間點與術前擺動相比較差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后3 天與術后7 天、14 天、28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后7 天與術后14 天、28 天、42天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后14 天與術后28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)；術后28 天與術后42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。對照組術后7 天、14 天、28 天與術前擺動相比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，術后3 天、42 天與術前擺動相比較，差異無統(tǒng)計學意義?？瞻捉M術前與術后各時間點擺動相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（見圖8）。

圖8 各時間點擺動相測量結(jié)果Fig. 8 Comparison of swing phase in the three groups in different time points

（4）擺動速度 (swing speed)

組間比較：手術前三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明手術前所有大鼠的擺動速度處于同一基線。術后3 天、7 天、14 天、28 天、42 天，實驗組與對照組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，對照組和空白組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（見圖9）。

組內(nèi)比較：實驗組術后各時間點與術前擺動速度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后3 天與術后7 天、14 天、28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后7 天與術后14 天、28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后14 天與術后28 天、42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；術后28 天與術后42 天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。對照組除術后3 天與其他時間點差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，其余術前與術后各時間點擺動速度比較，差異均無統(tǒng)計學意義?？瞻捉M術前與術后各時間點擺動速度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（見圖9）。

圖9 各時間點擺動速度測量結(jié)果Fig. 9 Comparison of swing speed in the three groups in diあerent time points

4. 關節(jié)突關節(jié)滑膜炎性因子含量測定結(jié)果

（1）關節(jié)突關節(jié)滑膜TNF-α 含量測定

實驗組術后42 天所測定的關節(jié)突關節(jié)滑膜TNF-α 含量，與空白組42 天關節(jié)突關節(jié)滑膜TNF-α含量進行組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（t 值為2.112，P ＜ 0.05）。實驗組與對照組術后3 天、7 天、14天、28 天、42 天各時間點所測定的關節(jié)突關節(jié)滑膜TNF-α 含量進行比較，術后3 天、7 天、14 天、28 天差異有統(tǒng)計學意義（t 值分別為2.285、6.824、5.753、3.114，P ＜ 0.05），術后42 天差異無統(tǒng)計學意義（t 值為1.638，P ＞ 0.05，見表1）。

表1 術后各時間點關節(jié)突關節(jié)滑膜TNF-α 含量測定結(jié)果(n = 6,±SD, pg/g)Table 1 Concentrations of TNF-a in the synovium of each group in different time points (n = 6,±SD, pg/g)

表1 術后各時間點關節(jié)突關節(jié)滑膜TNF-α 含量測定結(jié)果(n = 6,±SD, pg/g)Table 1 Concentrations of TNF-a in the synovium of each group in different time points (n = 6,±SD, pg/g)

*P ＜ 0.05，與空白組相比；#P ＜ 0.05，與對照組相比*P ＜ 0.05, compared with group blank; #P ＜ 0.05, compared with group control.

42 天42 days實驗組Experimental group 28.28±3.59# 65.15±6.77# 58.14±5.65# 31.74±4.78# 19.51±2.11*對照組Control group 19.98±1.59 25.32±1.46 23.73±1.98 19.31±2.12 18.17±1.23空白組Blank group 17.51±1.19 t 2.285 6.824 5.753 3.114 1.638 P＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 0.817組別Group 3 天3 days 7 天7 days 14 天14 days 28 天28 days

（2）關節(jié)突關節(jié)滑膜IL-1β 含量測定

實驗組術后42 天所測定的關節(jié)突關節(jié)滑膜IL-1β含量，與空白組42 天關節(jié)突關節(jié)滑膜IL-1β 含量進行組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（t 值為2.864，P ＜0.05）。實驗組與對照組于術后3 天、7 天、14 天、28 天、42 天各時間點所測定的關節(jié)突關節(jié)滑膜IL-1β含量進行比較，術后3 天、7 天、14 天差異有統(tǒng)計學意義（t 值分別為10.567、7.563、5.259，P ＜ 0.05），于術后28 天、42 天差異無統(tǒng)計學意義（t 值分別為1.985、1.732，P ＞ 0.05，見表2）。

表2 術后各時間點關節(jié)突關節(jié)滑膜IL-1β 含量測定結(jié)果(n = 6,±SD, pg/g)Table 2 Concentrations of IL-1β in the synovium of each group in different time points (n = 6,±SD, pg/g)

表2 術后各時間點關節(jié)突關節(jié)滑膜IL-1β 含量測定結(jié)果(n = 6,±SD, pg/g)Table 2 Concentrations of IL-1β in the synovium of each group in different time points (n = 6,±SD, pg/g)

*P ＜ 0.05，與空白組相比；#P ＜ 0.05，與對照組相比*P ＜ 0.05, compared with group blank; #P ＜ 0.05, compared with group control.

42 天42 days實驗組Experimental group 128.35±23.14# 93.56±15.38# 77.35±9.39# 35.15±4.78 30.19±3.96*對照組Control group 35.26±4.86 39.56±5.15 36.26±5.22 32.35±4.13 29.53±3.21空白組Blank group 28.26±2.91 t 10.567 7.563 5.259 1.985 1.732 P＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 0.028 0.437組別Group 3 天3 days 7 天7 days 14 天14 days 28 天28 days

5. 關節(jié)突關節(jié)組織形態(tài)學觀察

對照組關節(jié)突關節(jié)標本經(jīng)甲苯胺藍染色后，各時間點組織學觀察未見明顯差異，均表現(xiàn)為軟骨表面光滑，軟骨厚度正常，軟骨細胞排列整齊（見圖10A-E）。實驗組關節(jié)突關節(jié)標本經(jīng)甲苯胺藍染色后，隨時間延長，組織學表現(xiàn)出明顯變化，術后3天可見關節(jié)突關節(jié)間隙變狹窄，術后7 天可見軟骨下基質(zhì)染色變淺，術后14 天可見軟骨細胞減少，軟骨表面變粗糙，軟骨厚度變薄，術后28 天可見軟骨細胞進一步減少，軟骨厚度進一步降低，術后42 天可見軟骨表面不平整，出現(xiàn)細小裂紋（見圖10F-J）。

圖10 對照組和實驗組術后各時間點關節(jié)突關節(jié)軟骨甲苯胺藍染色（標尺= 100 μm）Fig. 10 Photomicrographs of facet joint cartilage stained with toluidine blue after operation in the control group and the experimental group (Bar scale = 100 μm)

討 論

腰痛在世界范圍內(nèi)是十分普遍的醫(yī)療和社會問題[1～4]，有研究指出，高達84%以上的成年人在一生之中曾經(jīng)受過腰痛的困擾[2]。然而對于腰痛的發(fā)病機制，目前仍有諸多不明之處[13]，腰痛的診斷和治療仍然是世界級的醫(yī)學難題。目前已知有多種因素參與這一病理變化，包括椎間盤退變、椎間關節(jié)損傷、肌肉筋膜炎癥等[14]。雖然多數(shù)研究均認為，腰痛與椎間盤退變存在十分密切的關聯(lián)[7]，但也應看到，并非所有椎間盤退變均會引起疼痛這一臨床癥狀。與椎間盤退變相似，腰椎關節(jié)突關節(jié)損傷與腰痛之間的關系同樣密切而存有大量未知之處。一方面，有研究[15,16]認為15%～45%的腰痛是由腰椎關節(jié)突關節(jié)因素產(chǎn)生，另一方面，也有研究[17,18]認為并非所有腰椎關節(jié)突關節(jié)骨關節(jié)炎病人均合并有腰痛癥狀。

眾所周知，制備動物模型是了解發(fā)病機制的重要途徑，雖然目前已有大量公認的椎間盤退變制模方法[19]和數(shù)量相對較少的關節(jié)突關節(jié)損傷制模方法，但椎間盤退變相關的疼痛模型和關節(jié)突關節(jié)損傷相關的疼痛模型均較少見。究其原因，與疼痛的評估方法困難有很大關系。疼痛既可產(chǎn)生于神經(jīng)末梢，也可產(chǎn)生于傳導通路[20]。疼痛作為一種主觀感受，不同人的感受程度差異很大[21]，但均可表現(xiàn)出疼痛敏感性的提高和疼痛閾值的降低[22,23]。另一方面，疼痛的評估方法也存在一定主觀性因素，現(xiàn)有的評估方法也存在一定誤差。

目前，對于動物疼痛模型的評估方法主要分兩類：一是誘發(fā)動物避退行為，測量相應刺激閾值的方法；二是觀察評價動物行為學改變的方法。雖然疼痛評估方法很多，但不同于人類疼痛能夠通過語言進行表述、動物疼痛的輕重程度難以準確測量。所以如何在活體動物上復制疼痛并評估疼痛，即建立疼痛動物模型，較在較大困難[24]。本研究中，空白組大鼠在術前和術后各時間點的MWT、TWL、步態(tài)分析各個指標均無明顯差異，說明在各時間點空白組大鼠的疼痛行為學特征處于同一基線。對照組大鼠在術后3～7 天出現(xiàn)MWT 降低、TWL 減小、足印面積減小、支撐相縮短、擺動相延長，以及擺動速度降低的表現(xiàn)，這些疼痛行為學改變與實驗大鼠經(jīng)受外科手術導致手術切口相關疼痛有關。這一點在術后切口觀察中有所表現(xiàn)，術后3 天通過對大鼠背部手術切口的觀察，可以發(fā)現(xiàn)切口周圍有明顯炎癥反應表現(xiàn)（如皮緣發(fā)紅、局部腫脹）。在術后14 至28 天以后，各個指標回歸到術前基線水平，并與空白組實驗動物無明顯差異，提示外科手術創(chuàng)傷期已經(jīng)結(jié)束，不再對疼痛行為學產(chǎn)生影響。實驗組大鼠在置入棘突間加壓彈簧后，彈簧的加壓作用從置入時刻一直持續(xù)到大鼠處死，腰椎關節(jié)突關節(jié)受到持續(xù)動態(tài)機械加壓作用，由此產(chǎn)生的損傷因子也是持續(xù)存在并發(fā)揮作用的，這導致疼痛相關行為學在術后3 天至42 天范圍內(nèi)持續(xù)發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為：MWT 降低、TWL 減小、足印面積減小、支撐相縮短、擺動相延長，以及擺動速度降低。但這種變化趨勢并不是均勻的。術后10 至14 天內(nèi)，疼痛行為學指標發(fā)生急劇變化，并達到高峰。這是由于在這一階段，關節(jié)突關節(jié)加壓產(chǎn)生的作用與外科手術創(chuàng)傷引起的疼痛作用疊加。之后變化曲線趨于平緩，并有輕度向正常回歸的趨勢。這種變化首先說明彈簧加壓的作用是持續(xù)的，同時彈簧的拉力并不是完全固定的，會隨著彈簧的長度動態(tài)變化，隨著時間延長，痛閾發(fā)生變化，并逐漸適應彈簧的加壓作用，所以會出現(xiàn)輕度回歸的變化趨勢。

為了進一步證實關節(jié)突關節(jié)源性疼痛在動物模型中的復制，本研究對腰椎關節(jié)突關節(jié)滑膜炎性因子進行測定和關節(jié)軟骨形態(tài)學評價。TNF-α 和IL-1β 都是炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用的細胞因子，在關節(jié)突關節(jié)源性疼痛中同樣發(fā)揮著重要的作用。Henry 等[25]在腰椎關節(jié)突關節(jié)短時加壓模型導致關節(jié)突關節(jié)源性疼痛動物模型中發(fā)現(xiàn)，造模大鼠在關節(jié)突關節(jié)受到異常機械加壓應力的28 天后，檢測到關節(jié)突關節(jié)滑膜中TNF-α 和IL-1β 均有高表達。Xu 等[26]在腰椎管狹窄癥的病人中，發(fā)現(xiàn)腰椎關節(jié)突關節(jié)滑膜中的IL-1β 顯著升高，同時發(fā)現(xiàn)IL-1β的表達量與關節(jié)突關節(jié)退變的嚴重程度呈正相關。以上研究均證實TNF-α 和IL-1β 在關節(jié)突關節(jié)源性腰痛，特別是早期病程中的重要作用。本研究結(jié)果同樣證實，當大鼠腰椎關節(jié)突關節(jié)受到持續(xù)機械加壓應力損傷后，會產(chǎn)生能夠?qū)е麓笫筇弁聪嚓P行為學改變的疼痛作用。與此同時，關節(jié)突關節(jié)滑膜中的疼痛相關炎癥因子，主要是TNF-α 和IL-1β 的表達量也發(fā)生相同趨勢的升高。這種改變在病程早期，同時也是疼痛相關行為學改變最明顯的階段，最為明顯。同樣，在關節(jié)突關節(jié)持續(xù)加壓過程中，腰椎關節(jié)突關節(jié)組織形態(tài)學也同步展現(xiàn)出骨關節(jié)炎的病理改變，如關節(jié)間隙變窄、軟骨細胞減少、軟骨厚度變薄、軟骨表面不平整等。由此提示，腰椎關節(jié)突關節(jié)退變的各個階段，細胞因子起著十分重要的作用?？梢哉雇?，如果將這些細胞因子的受體阻滯劑注入相應靶點，有可能逆轉(zhuǎn)腰椎關節(jié)突關節(jié)的退變過程。Fernandes 等[27]曾在動物研究中，將重組IL-1 受體阻滯劑注射入兔膝關節(jié)腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能夠顯著改善關節(jié)軟骨的退變。腰椎關節(jié)突關節(jié)作為一種真正的滑膜關節(jié)，也有理由相信，應用特異性單克隆抗體對關節(jié)突關節(jié)退變進行靶向治療，阻斷相應信號通路，能夠獲得有效而準確的治療效果。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。