NLRP3 炎性小體抑制劑MCC950 對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的保護(hù)作用*

王國鎮(zhèn) 劉紫佳 唐 鐸 呂卓洋,3 楊怡姝 張 鐵 周志祥△

（1 北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京100124；2 中日友好醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100029；3 北京新府學(xué)外國語學(xué)校，北京101300）

痛風(fēng)是一種代謝性疾病，嘌呤代謝異?；蚰蛩崤判拐系K引起的尿酸鈉晶體，沉積于關(guān)節(jié)及周圍組織導(dǎo)致該疾病，其發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)不斷上升。男性的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性[1]，并且呈現(xiàn)年輕化的趨勢[2]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis)是由單鈉尿酸鹽(monosodium urate, MSU)晶體沉積于關(guān)節(jié)腔組織中引起的急性炎性反應(yīng)，炎癥細(xì)胞、炎性小體及細(xì)胞因子在其發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛，嚴(yán)重的會影響肢體功能障礙，從而影響正常生活[3]。目前臨床治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的常用藥物主要為別嘌醇、苯溴馬隆和丙磺舒，雖然取得了一定的成效，但均會出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，如病人用藥后常出現(xiàn)胃腸道毒性和腹瀉、出血和心血管疾病等，藥物依從性不佳[4]。因此還需尋找更有效的治療或減輕急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的新型藥物。

近年來，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的分子和細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制研究表明，MSU 沉積于關(guān)節(jié)腔中，誘導(dǎo)白細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等）趨化聚集。細(xì)胞吞噬MSU 晶體后激活固有免疫系統(tǒng) Nod 樣受體蛋白 3 (Nod like receptor pyrin domain containing 3, NLRP3)炎性小體活化[5]，進(jìn)而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-l (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)，促進(jìn)白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、IL-18 等致炎性因子的切割成熟以及細(xì)胞外釋放，導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作[6～8]。因此，NLRP3 炎性小體激活是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，也可能是治療或減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的新靶點(diǎn)。

已有研究表明，MCC950 是一種有效的NLRP3炎性小體抑制劑。MCC950 與NLRP3 炎性小體結(jié)合而阻止其活性，導(dǎo)致IL-1β、IL-18 等致炎性因子無法成熟與釋放[9]。MCC950 在一系列涉及NLRP3疾病的體外和體內(nèi)研究中得到了廣泛應(yīng)用，包括冷凍蛋白相關(guān)周期性綜合征 (cryopyrin associated periodic syndrome, CAPS)、炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease, IBD)、非酒精性脂肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、風(fēng)濕、阿爾茨海默病和急性肺損傷[10,11]。然而，關(guān)于MCC950 抑制NLRP3 炎性小體是否緩解MSU 誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀，還未見報道。因此，本研究利用MSU 誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，探究MCC950 對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證NLRP3 炎性小體在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中的作用機(jī)制，也為開發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療藥物提供新思路。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動物

選取2 月齡SPF 級SD 雄性成年大鼠21 只，體重 (200±20) g，由中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心統(tǒng)一購買并喂養(yǎng)，動物合格證號：SYXK（京）2016-0043。所有操作及動物處理均嚴(yán)格遵循相關(guān)動物保護(hù)及使用規(guī)定（動物倫理審批號：zryhyy21-21-06-02）。

2.實(shí)驗(yàn)材料

20%尿酸鈉溶液：取10 g 尿酸鈉晶體（Sigma，批號101498747）加入45 ml 生理鹽水，再加入5 ml吐溫80，加溫攪拌，制成20%的尿酸鈉溶液。10%水合氯醛溶液：稱取25 g 水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號 20200706），加適量水溶解，待水合氯醛完全溶解后，加水定容至250 ml。組織脫鈣液：稱取100 g EDTA（北京益利精細(xì)化工，批號20200810）后，加入溫?zé)?60℃～70℃)注射用水450 ml，加入15 g NaOH，攪拌至透明，加入500 ml 磷酸鹽緩沖劑(PBS)，調(diào)節(jié)pH 值至7.2～7.3，加入蒸餾水定容至1000 ml。免疫組化相關(guān)抗體為MCC950 抗體（MCE 公司，貨號HY-12815A-50）、GSDMD 抗體（Invitrogen 公司，貨號PA5-116815）、NLRP3 抗體（Invitrogen 公司，貨號PA5-79740）、caspase-1 抗體（Proteintech 公司，貨號22915-1-AP）、酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒購自北京浩軒凱文生物科技有限公司，相關(guān)抗體為大鼠血清IL-6（Abcam 公司，貨號ab234570-96t）、TNF-α（Proteintech 公司，貨號KE20001-96T）、IL-1β（Proteintech 公司，貨號20005-96T）。

3.實(shí)驗(yàn)方法

大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建過程中，所有動物采用SPSS 軟件進(jìn)行隨機(jī)分組，方法見參考文獻(xiàn)[12]。將在SPF 環(huán)境下飼養(yǎng)1 周后的21 只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為造模組（MSU 組）、治療組（MSU +MCC950 組）、對照組（生理鹽水組），每組7 只。采用10%水合氯醛以0.35 ml/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，然后將大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)擺放成直角，充分暴露踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的間隙，75%酒精局部皮膚消毒，4 號針頭以45 度角從該間隙插入右后肢背側(cè)正中踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的關(guān)節(jié)腔，分別注入100 μl 20%尿酸鈉溶液及100 μl 生理鹽水溶液。觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況及步態(tài)，若大鼠出現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)活動受限，提示造模成功。造模成功后即刻給予藥物干預(yù)，生理鹽水組及MSU 組分別給予2 ml 生理鹽水灌胃；MSU + MCC950 組給予2 ml、0.75 mg/ml的MCC950 灌胃，每日灌胃2 次，連續(xù)給藥2 天。

4.觀察指標(biāo)

（1）測定大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度及步態(tài)行為學(xué)評級：測定大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度，測定時固定好大鼠右后足踝關(guān)節(jié)，測量右后足踝關(guān)節(jié)下5 mm 處的直徑，進(jìn)行2 次測量求平均值，并計算關(guān)節(jié)腫脹程度（造模后直徑—造模前直徑）；步態(tài)行為學(xué)評級：觀察模型制備后0～48 h 內(nèi)大鼠步態(tài)變化，評價標(biāo)準(zhǔn)0級：正常步態(tài)，雙足均勻著地；1 級：足著地減輕，足趾未展開，輕度跛行；2 級：足屈起，趾背著地，明顯跛行；3 級：為足完全離地，三足步態(tài)。

（2）病理觀察：采用10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉后處死大鼠，分離大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)組織，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定48 h，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切片，切片厚度為4 μm。蘇木素-伊紅染色后脫水，二甲苯進(jìn)行透明處理，滴加中性樹脂進(jìn)行封片，光鏡下觀察關(guān)節(jié)周圍組織及滑膜組織形態(tài)。

（3）免疫組化觀察大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、caspase-1 蛋白含量：取石蠟切片脫蠟至水，浸入哈瑞 (Harris) 氏蘇木精染液15 min，自來水洗去多余染液。0.5%鹽酸乙醇溶液分化30 s，自來水（弱堿性水）洗10 min。伊紅染色10 min，自來水洗去多余染液。80%、90%、95%、無水乙醇I、無水乙醇II逐級脫水、二甲苯I、二甲苯II 透明，中性樹膠封固；石蠟切片脫蠟至水，pH9.0 Tris-EDTA 溶液抗原修復(fù)10 min，3%過氧化氫溶液封閉15 min，10%山羊血清封閉30 min，一抗孵育過夜(GSDMD, 1:400;NLRP3, 1:400; caspase-1, 1:200)，二抗（Dako 公司，K5007）孵育60 min，DAB 顯色3 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明，中性樹脂封片。染色后的切片使用光學(xué)顯微鏡(Olympus, BX53)，在200 倍光鏡下每張切片隨機(jī)選取5 個視野進(jìn)行拍照，采用Image Pro Plus 6.0 醫(yī)學(xué)圖像分析軟件計算圖片中GSDMD、NLRP3 及caspase-1 的積分光密度 (integrated optical density, IOD)，取IOD 平均值作為衡量該只大鼠該指標(biāo)的相對蛋白表達(dá)量。

（4）大鼠血清細(xì)胞因子檢測：大鼠造模第48 h后，采用10%水合氯醛0.35 ml/100 g 腹腔注射麻醉后處死，腹主動脈取血5 ml，3000 r/min，離心10 min，分離血清，保存?zhèn)溆?。?yán)格按照ELISA 檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子水平。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，等級資料采用Fisher 檢驗(yàn)，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，組間對比采用單因素方差分析，P ＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. MCC950 減輕MSU 引發(fā)大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度

按照文獻(xiàn)中的方法，在造模前、造模后(0 h、4 h、8 h、24 h、48 h)分別觀察各組大鼠一般情況、步態(tài)、踝關(guān)節(jié)腫脹情況[13]（造模前后采用游標(biāo)卡尺測定大鼠右后足踝關(guān)節(jié)直徑）。如表1 結(jié)果所示，MSU 組大鼠造模后4 h 即出現(xiàn)右后側(cè)踝關(guān)節(jié)明顯腫脹，右后足行動受限，活動減少、食量減少、倦怠嗜臥、精神不振等全身表現(xiàn)并出現(xiàn)右后足跛行步態(tài)，8～24 h 之間達(dá)到高峰，出現(xiàn)單足行走，48 h 后癥狀出現(xiàn)減輕。

表1 大鼠步態(tài)行為評級比較Table 1 Comparison of gait behavior scores in rats of different group

MSU + MCC950 組在造模4 h 后逐漸出現(xiàn)不同程度的跛行，8 h 后達(dá)到高峰，24 h 后跛行開始逐漸減少，24 h 后大鼠一般情況明顯好于MSU 組，飲食及精神狀態(tài)正常。生理鹽水組大鼠活動自如，未見跛行及單足行走的情況出現(xiàn)。MSU 組大鼠步態(tài)評分顯著高于生理鹽水組及MSU + MCC950 組(P ＜0.05)，各組踝關(guān)節(jié)步態(tài)評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜ 0.05)。MSU + MCC950 組踝關(guān)節(jié)腫脹程度低于MSU 組，尤其8 h 后MSU + MCC950 組較MSU 組的踝關(guān)節(jié)腫脹程度顯著降低（P ＜ 0.05，見圖1）。

圖1 大鼠建模后踝關(guān)節(jié)腫脹程度Fig.1 Degree of ankle joint swelling in rat models

2. MCC950 減輕MSU 引發(fā)的關(guān)節(jié)炎性浸潤及炎性小體水平

組織病理檢測顯示，MSU 組有大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜組織可見明顯增生，炎癥反應(yīng)明顯。MSU + MCC950 組與MSU 相比，組織病理炎癥反應(yīng)較輕，炎性細(xì)胞浸潤較少，滑膜組織細(xì)胞分布較均勻；生理鹽水組無明顯炎性細(xì)胞浸潤，滑膜層組織細(xì)胞分布均勻，無明顯組織水腫出現(xiàn)（見圖2）。

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理結(jié)果（HE 染色）Fig. 2 Histopathological results of the ankle joints in each group of rats (HE staining)

免疫組化結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，MSU組中NLRP3、caspase-1 蛋白在組織中表達(dá)量顯著升高；MSU + MCC950 組中NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)量顯著低于MSU 組（P ＜ 0.01，見圖3、4）。

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理NLRP3 免疫組化結(jié)果Fig. 3 The results of NLRP3 immunohistochemistry in ankle joint of rats in each group

3. MCC950 減輕MSU 引發(fā)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎性因子水平

與生理鹽水組相比，MSU 組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著升高(P ＜ 0.05)，MSU + MCC950組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著低于MSU組（P ＜ 0.05，見圖5）。

圖5 各組大鼠炎性因子水平比較Fig. 5 Comparison of the levels of inflammatory factors in diあerent group of rats

討 論

NLRP3 炎癥信號通路是大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中一條重要的信號通路。在本研究中，使用NLRP3炎性小體抑制劑MCC950 治療MSU 誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，NLRP3 炎性小體抑制劑MCC950 可有效減輕大鼠出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，顯著降低一些炎癥反應(yīng)指標(biāo)。本研究也進(jìn)一步證明了NLRP3 炎性小體在用MSU 誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中發(fā)揮重要作用。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，MSU 晶體誘導(dǎo)的大鼠造模組中，造模后4 h 就會出現(xiàn)右后側(cè)踝關(guān)節(jié)的明顯腫脹，右后足行動明顯受限，大鼠活動減少、食量減少、倦怠嗜臥、精神不振等全身表現(xiàn)并出現(xiàn)右后足跛行步態(tài)，這種狀態(tài)會在8 h～24 h 之間達(dá)到高峰，即出現(xiàn)單足行走現(xiàn)象。這些癥狀與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)基本一致，對大鼠的肢體功能造成了巨大影響。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，巨噬細(xì)胞在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的初始階段起著核心作用。在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中，沉積于關(guān)節(jié)處的尿酸鈉晶體被巨噬細(xì)胞吞噬識別后，NLRP3 炎性小體可感知刺激，通過NLRP3 炎癥通路的作用，進(jìn)而激活caspase-1 蛋白，活化的caspase-1 蛋白靶向激活I(lǐng)L-1β 前體蛋白，使之成為成熟的IL-1β 炎性因子，進(jìn)而控制IL-1β、IL-6 和TNF 等炎性因子的成熟和分泌[14,15]。NLRP3炎性小體在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中起到關(guān)鍵作用[16]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組大鼠相比，MSU 晶體誘導(dǎo)的大鼠造模組中膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片炎癥細(xì)胞浸潤情況明顯加重，關(guān)節(jié)滑膜組織NLRP3和caspase-1 蛋白表達(dá)量顯著升高，并均具有統(tǒng)計學(xué)意義，這與既往的研究相一致[17]。同時IL-1β、IL-6和TNF 等炎性細(xì)胞因子作為NLRP3 炎癥通路的下游炎性因子，是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)鍵功能分子[18～21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，造模組中大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白水平表達(dá)量顯著升高。以上結(jié)果表明，MSU 晶體誘導(dǎo)后的大鼠可表現(xiàn)出強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，NLRP3 炎性小體在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中發(fā)揮重要作用。

圖4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理caspase-1 免疫組化結(jié)果Fig. 4 The results of caspase-1 immunohistochemistry in ankle joint of rats in each group

已有報道MCC950 是有效阻斷NLRP3 炎性小體激活的高選擇性小分子抑制劑，進(jìn)而抑制IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎性因子的分泌，因而可以有效改善炎性因子帶來的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)[9,22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在MSU 誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型中，采用MCC950 治療后，與生理鹽水組相比，大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度和膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片炎癥細(xì)胞浸潤情況得到顯著緩解，關(guān)節(jié)滑膜組織NLRP3、caspase-1 和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白水平表達(dá)量均顯著降低。與文獻(xiàn)報道有關(guān)MCC950 在其他炎癥性疾病模型中的治療作用及機(jī)制相似[23]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床治療藥物主要有抑制尿酸生成藥、促進(jìn)尿酸排泄藥、痛風(fēng)急性發(fā)作期藥物3 種類型，但均存在不同程度的不良反應(yīng)，并沒有呈現(xiàn)很好的治療效果[24,25]。本研究發(fā)現(xiàn)MCC950 可能通過抑制NLRP3 炎性小體及NLRP3 炎癥通路，改善和緩解大鼠的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。從而提示MCC950 在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療中的潛在應(yīng)用價值。

綜上所述，NLRP3 炎性小體抑制劑MCC950可以有效緩解MSU 誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，NLRP3 炎性小體可能是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在新型靶點(diǎn)，本研究為開發(fā)抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎新的小分子抑制劑提供新的思路。未來工作還需要深入研究MCC950 在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中抑制NLRP3 炎性小體的信號通路，以及采用關(guān)節(jié)組織中巨噬細(xì)胞等細(xì)胞模型，深入揭示MCC950 治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的分子細(xì)胞生物學(xué)作用機(jī)制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。