基于高分辨質(zhì)譜及三重四極桿質(zhì)譜的蘑菇中7種蘑菇毒素的篩查及定量分析

羅 蘋 劉小紅 孔 芳 唐 琳 聞 勝 李永剛

（湖北省疾病預(yù)防控制中心，應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079）

毒蘑菇亦稱毒菌、毒蕈等，是指大型真菌的子實(shí)體食用后對人或畜禽產(chǎn)生中毒反應(yīng)的物種[1～2]。我國已知蘑菇種類估計(jì)在4 000種以上，其中可食用的野生蘑菇936種，毒蘑菇435種[3～5]。毒蘑菇具有分布廣泛、形態(tài)特征復(fù)雜、生長環(huán)境多變等特點(diǎn)。很多毒蘑菇與可食用野生蘑菇外形類似，人們極易混淆導(dǎo)致誤食。由毒蘑菇引起的群體性中毒事件，特別是家庭聚集性中毒事件頻發(fā)[6]。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，毒蘑菇中毒總體病死率為12.39%，個體致死率高達(dá)90%，誤食毒蘑菇中毒已經(jīng)成為我國食物中毒事件中導(dǎo)致死亡的主要原因[7～8]。由于蘑菇的種類不同，所含毒素也不同，已確定的毒性較強(qiáng)且較常見的蘑菇毒素主要有環(huán)型多肽類毒素、鵝膏蕈氨酸、毒蠅堿、毒蠅母、鬼傘素、脫磷酸裸蓋菇素等[9]。其中，環(huán)型多肽類毒素中的鵝膏毒肽分為α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽3種同分異構(gòu)體；鬼筆毒肽分為羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽[10～11]。上述幾種蘑菇毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，日常烹調(diào)與加工方式均不能破壞其毒性，故成為蘑菇中毒的主要因素[12～13]。含有鵝膏蕈氨酸、毒蠅母的毒蘑菇主要作用于人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，會引起不同程度的神經(jīng)和精神功能障礙[2，14]。

目前，針對蘑菇毒素的檢測方法有薄層層析法[15～17]、 放射免疫法[18]、 酶聯(lián)免疫法[19～20]、 液相 色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[21～24]等，這些方法僅限于有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)狀況下的檢測運(yùn)用，而在應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件、檢測食物中毒致病物質(zhì)時常面臨無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的狀況。鑒于此，本研究用高分辨質(zhì)譜技術(shù)[25～27]建庫，目的是在發(fā)生蘑菇中毒時能快速應(yīng)對，進(jìn)行篩查定性，給醫(yī)生及時救助病人提供必要的技術(shù)支持。同時，三重四極桿質(zhì)譜在準(zhǔn)確定量分析化合物方面較高分辨質(zhì)譜更有優(yōu)勢。因此，本研究擬利用不同的技術(shù)手段分別開發(fā)篩查和定量方法，擬先采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法對野生毒蘑菇子實(shí)體中5種毒肽（α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽）、1種毒蠅堿（毒蠅母）和1種異噁唑衍生物（鵝膏蕈氨酸）進(jìn)行篩查，后通過超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法對這7種蘑菇毒素進(jìn)行確證以及對篩查結(jié)果進(jìn)行定量分析，以建立針對這7種蘑菇毒素的先篩查后確證的定性、定量檢測方法，旨在為突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置和應(yīng)急檢測提供技術(shù)支撐。

一、材料與方法

（一）試劑甲醇、乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma公司）；標(biāo)準(zhǔn)品α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽、毒蠅母和鵝膏蕈氨酸（純度≥99%，色譜純，美國Enzo Life Sciences公司）。

（二）儀器與設(shè)備Q Exactive四極桿串聯(lián)靜電場軌道高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1290 Infinity II-6495C三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（美國Waters公司）；Fresco 17離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；VXMAL渦旋混合器（德國OHAUS公司）；AB135-S電子天平（十萬分之一，瑞士Metter Toledo公司）；SB-3200DT超聲波清洗器（中國昆山市超聲儀器有限公司）；FDU-1200冷凍干燥機(jī)（日本EYELA公司）；粉碎機(jī)［螞蟻源科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

（三）試驗(yàn)方法

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：取7種蘑菇毒素標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，溶于1 mL乙腈，配制成濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于-20℃下保存。

7種蘑菇毒素的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（10 μg/mL）的配制：準(zhǔn)確量取α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽、毒蠅母、鵝膏蕈氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各100 μL，分別加入乙腈定容至10 mL，于-20℃下冷凍保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1 μg/mL）的配制：各取7種蘑菇毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（10 μg/mL）100 μL，加入乙腈定容至1.0 mL，混勻，于-20℃下冷凍保存。

2.樣品前處理方法。根據(jù)《常見化學(xué)性食物中毒物質(zhì)實(shí)用檢測技術(shù)》[28]一書中對蘑菇干粉制備與處理方法的介紹，設(shè)計(jì)本研究的樣品前處理方法。

樣品制備：蘑菇樣品經(jīng)冷凍干燥后用粉碎機(jī)粉碎成粉末備用。

提?。簻?zhǔn)確稱取蘑菇干粉樣品0.20 g于50 mL離心管中，加入8 mL超純水，超聲提取15 min，以10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至15 mL離心管中。向含殘?jiān)碾x心管中加入6 mL超純水，振搖混勻，重復(fù)提取一次，離心后合并兩次上清液。

凈化：依次用2 mL乙腈、2 mL水對HLB柱（100 mg/6 mL）進(jìn)行活化，再將上述提取液全部過柱，依次向柱內(nèi)加4 mL水、1 mL甲醇-水溶液（15∶85，V/V）清洗，后用2 mL甲醇-乙腈溶液（2∶8，V/V）洗脫，收集洗脫液進(jìn)行氮吹，用200 μL甲醇-水溶液（3∶7，V/V）復(fù)溶后過0.22 μm濾膜，待測。

3.液相色譜條件。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為40℃；流速為0.3 mL/min；流動相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

4.高分辨質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI）；霧化器流速為11 L/min；霧化器壓力為241.32 kPa；毛細(xì)管電壓為3 500 V；鞘氣流速為12 L/min；鞘氣溫度為270℃；傳輸電壓為380 V；霧化器溫度為320℃。

一級全掃方式為正離子掃描；母離子掃描分辨率為70 000；掃描范圍為m/z150～2 000；動態(tài)隔離窗口為20 s；自動增益控制進(jìn)入軌道阱中的離子數(shù)（AGC target）為3×106。裂解模式為高能碰撞誘導(dǎo)解離模式（HCD）。

數(shù)據(jù)依賴二級掃描（dd-MS2）參數(shù)：掃描分辨率為17 500；歸一化碰撞能量為20%、40%、70%；自動增益控制進(jìn)入軌道阱中的離子數(shù)為1×105；循環(huán)次數(shù)為20次；隔離窗口為2.0m/z。

5.三重四極桿質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描模式為正離子模式；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測；電噴霧毛細(xì)管電壓為3.5 kV；離子源溫度為200℃；霧化器流速為11 L/min；霧化氣壓力為241.32 kPa；霧化氣為氮?dú)?；鞘氣流速?2 L/min；7種目標(biāo)化合物的三重四極桿質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表2 7種蘑菇毒素的三重四極桿質(zhì)譜條件參數(shù)

二、結(jié)果與討論

（一）超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜對7種蘑菇毒素的篩查本研究利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜，將各蘑菇毒素的單標(biāo)溶液在電噴霧離子源正離子（ESI+）掃描模式下，采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2）模式結(jié)合目標(biāo)離子列表（Inclusion list）的數(shù)據(jù)采集方法依次進(jìn)樣分析，由此建立7種蘑菇毒素的靶向篩查數(shù)據(jù)庫。在各蘑菇毒素精確相對分子質(zhì)量±5范圍內(nèi)手動提取[M+H]+下的提取離子流色譜圖（EIC），獲得目標(biāo)化合物的一級母離子精確質(zhì)量數(shù)及保留時間，在其保留時間下進(jìn)一步提取二級質(zhì)譜圖，獲得目標(biāo)化合物的二級碎片離子信息。建立的靶向篩查數(shù)據(jù)庫包含7種蘑菇毒素的中英文名稱、CAS號、化學(xué)分子式、理論和實(shí)測母離子相對分子質(zhì)量及其保留時間、主要碎片離子相對分子質(zhì)量等信息（見表3）。在無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的狀況下，可利用該數(shù)據(jù)庫來實(shí)現(xiàn)蘑菇中7種毒素的快速篩查。

表3 7種蘑菇毒素的靶向篩查數(shù)據(jù)庫

（二）三重四極桿質(zhì)譜確證定量參數(shù)的優(yōu)化在確定了7種蘑菇毒素母離子和子離子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化三重四極桿質(zhì)譜參數(shù)，使每種蘑菇毒素的離子化效率達(dá)到最佳，最終7種蘑菇毒素的三重四極桿質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。經(jīng)過優(yōu)化，7種蘑菇毒素離子峰峰形較好，響應(yīng)值高（見圖1）。

圖1 7種蘑菇毒素定量離子的色譜圖

（三）方法學(xué)考察

1.線性關(guān)系與檢出限。取1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用乙腈逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為20、40、80、160、480、1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)測定，以目標(biāo)分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，7種蘑菇毒素在20～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.996 0～0.999 6之間（見表4），以3倍信噪比（S/N）計(jì)算得到7種蘑菇毒素的檢出限范圍為0.4～5.8 μg/kg，以10倍S/N計(jì)算得到其定量限范圍為1.3～19.1 μg/kg。

表4 7種蘑菇毒素的線性方程、檢出限和定量限

2.精密度與回收率。對空白可食用蘑菇干粉樣品進(jìn)行高（480 μg/kg）、中（160 μg/kg）、低（40 μg/kg）3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個水平平行測定4次，外標(biāo)法定量，結(jié)果見表5。7種蘑菇毒素的平均回收率在79.7%～117.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.9%～9.4%之間。

表5 7種蘑菇毒素的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （%）

（四）實(shí)際樣品檢測應(yīng)用本研究所建立的方法對湖北省咸豐縣、宜昌市、丹江口市、安陸市等地發(fā)生的蘑菇中毒事件中采集的蘑菇樣品進(jìn)行了檢測。首先，用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜對采集的蘑菇樣品中的7種蘑菇毒素進(jìn)行篩查分析，結(jié)果顯示，咸豐縣的野生蘑菇樣品中檢出4種蘑菇毒素，分別是α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽，其余均未檢出；宜昌市、丹江口市小吃店的蘑菇樣品和安陸市木梓鄉(xiāng)日常采摘的蘑菇樣品中均檢出鵝膏蕈氨酸，其余6種未檢出。隨后，應(yīng)用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法對檢出陽性的蘑菇樣品進(jìn)行定量分析（測定結(jié)果均以干重計(jì)），結(jié)果顯示，咸豐縣蘑菇樣品中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽4種毒素的含量分別為4 049、324、806、1.79 mg/kg；宜昌市、丹江口市和安陸市木梓鄉(xiāng)蘑菇樣品中的鵝膏蕈氨酸含量分別為0.036、0.053、0.027 mg/kg。

三、結(jié)論

本研究建立了一種基于高分辨質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜的蘑菇中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽、毒蠅母、鵝膏蕈氨酸7種蘑菇毒素的篩查及定量方法。該方法能夠快速、簡單、準(zhǔn)確地對蘑菇樣品中毒肽類、毒蠅堿及異噁唑衍生物等毒素進(jìn)行定性和定量分析，適合用于蘑菇中毒等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急檢測及風(fēng)險評估，可為我國居民的食品安全保障提供技術(shù)支撐。