養(yǎng)殖池塘14株芽孢桿菌的分離鑒定及抑菌效果

陳皓祥，鄧益琴，程長洪，馬紅玲，郭志勛，馮 娟

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣州 510300;2. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

中國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模位居世界首位，大規(guī)模養(yǎng)殖導致病害的頻發(fā)。當前廣泛采用的病害防控方法是藥物防控，即廣譜抗生素和化學藥物防控，且抗生素被認為是對抗細菌性傳染病最有效、最靈活的武器，被廣泛用于預防或治療水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細菌性疾病[1?2]。然而，抗生素的過度使用，一方面造成藥物殘留，可能積聚在水產(chǎn)動物可食用組織中，導致人體過敏、中毒、腸道菌群紊亂等[3]。如2013年，青島抽檢海參中檢出呋喃唑酮和呋喃西林代謝物。人攝入呋喃唑酮，會引起惡心、嘔吐、多發(fā)性神經(jīng)炎[4]。同時，水產(chǎn)動物抗生素的過度使用導致其耐藥和多重耐藥細菌被選擇和積累[5]，如溫州地區(qū)水產(chǎn)品中哈維弧菌（Vibrio harveyi）對磺胺嘧啶和氨芐西林鈉的耐藥率達到100%[6]；廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)的1 143株氣單胞菌（Aeromonasspp.）對氨芐西林的耐藥率高達97.81%[7]。為了水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展，尋找抗生素等藥物的替代品尤為重要。目前抗生素替代品的研究熱點是益生菌、中草藥、噬菌體、免疫糖類等[8]。益生菌因其健康、安全的優(yōu)點，擁有廣闊的應用前景[9]。芽孢桿菌（Bacillusspp.）是最早應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的一種益生菌，且無污染、抗菌性強，是理想的微生物制劑[10]。在養(yǎng)殖水體中添加芽孢桿菌，可以有效降低水體的氨氮、亞硝氮、活性磷和化學需氧量[11?14]。此外，還可以改善水體中真核生物和細菌群落的結(jié)構(gòu)，有效抑制藍藻的生長[15?18]。在飼料中添加一定量的芽孢桿菌可以顯著提升養(yǎng)殖動物的生長、免疫狀態(tài)和抗病能力[19?22]。芽孢桿菌還可以減輕嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）對細胞的損傷，抑制副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的 生 長[23?24]，對 哈 維 弧 菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、殺香魚假氣單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、燦爛弧 菌（Vibrio splendidus）和 嗜 水 氣 單 胞 菌（A.hydrophila）都有良好的拮抗作用[22,25?27]，對溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）存在明顯的體外抑菌能力，對遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也有抑制作用[28?29]。芽孢桿菌的抑菌效果主要來自其產(chǎn)生的細菌素、多糖化合物以及其他代謝產(chǎn)物[30?31]。

筆者從養(yǎng)殖池塘中分離、鑒定得到14株芽孢桿菌，并以40株水產(chǎn)病原菌為指示菌，研究14株芽孢桿菌對其的抑制作用，同時，也比較不同培養(yǎng)時間的芽孢桿菌上清液和全菌液的抑菌效果，旨在為芽孢桿菌在防治水產(chǎn)動物疫病中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑LB固體培養(yǎng)基（1 L）：1 000 mL純凈水，胰蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉18 g，pH調(diào)至7.3～7.5。LB液體培養(yǎng)基（1 L）：1 000 mL純凈水，胰蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，NaCl 10 g， pH7.3～7.5。

1.2 芽孢桿菌的分離與鑒定從廣州市南沙區(qū)的3個擬穴青蟹（Scylla paramamosai）養(yǎng)殖池溏采集水樣，每個池塘在池塘4個角各采集水樣500 mL，共得到12個水樣。每個水樣取50 mL于50 mL無菌試管，沸水浴15 min；將沸水處理的養(yǎng)殖水樣經(jīng) 滅 菌 生 理 鹽 水10倍 倍 比 稀 釋 至10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?6等6個梯度；取100 μL稀釋水樣分別涂布至LB固體平板（每個稀釋度做3個平行）；28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后取出平板觀察；挑取表面干燥扁平狀的單菌落，LB平板劃線純化2次后用LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、200 r·min?1培養(yǎng)過夜，用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，利用16S rDNA 通用引物（表1）進行PCR擴增，并進一 步 測 序 和Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析鑒定，同時利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。對鑒定為芽孢桿菌的菌株進行后續(xù)實驗。

表1 16S rDNA引物序列

1.3 芽孢桿菌24 h全菌液的抑菌效果分析芽孢桿菌制備：芽孢桿菌于LB平板劃線活化，然后挑取單克隆于2 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、搖床（200 r·min?1）培養(yǎng)24 h。指示菌制備：從實驗室菌庫中挑選出25種共計40株水產(chǎn)病原菌株作為指示菌（表2），水產(chǎn)病原菌株于LB平板劃線活化，然后挑取單克隆于2 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、搖床（200 r·min?1）培養(yǎng)24 h。正方形LB平板制備：12 cm邊長的正方形平板用50 mL LB固體培養(yǎng)基配置；取200 μL指示菌涂布平板，晾干后用10 μL槍頭倒置鉆孔，每個平板14個孔，每孔加入50 μL芽孢桿菌，每株指示菌3個重復，正置28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況，并測量抑菌圈直徑。

表2 40株水產(chǎn)病原菌

1.4 芽孢桿菌24 h上清液抑菌效果分析芽孢桿菌上清液制備：將1.3中過夜培養(yǎng)的芽孢桿菌離心2 min (8 000 r·min?1)，取上清液。指示菌制備：選取1株有明顯指示效果的菌株挑單克隆于2 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、搖床（200 r·min?1）培養(yǎng)24 h；取200 μL過夜指示菌涂布LB平板，晾干后用10 μL槍頭倒置鉆孔，每個平板14個孔，每孔加入50 μL芽孢桿菌上清液，每株指示菌3個重復，正置28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況，并測量抑菌圈直徑。抑菌率=抑菌數(shù)量/總指示菌數(shù)量×100%。

1.5 芽孢桿菌24 h培養(yǎng)全菌液與48 h培養(yǎng)全菌液的抑菌效果對比分析芽孢桿菌制備：挑取單克隆于2 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、搖床（200 r·min?1）培養(yǎng)24 h和48 h。指示菌制備：選取1株有明顯指示效果的菌株挑單克隆于2 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、搖床（200 r·min?1）培養(yǎng)24 h；取200 μL過夜指示菌涂布LB平板，晾干后用10 μL槍頭倒置鉆孔，每個平板14個孔，每孔加入50 μL芽孢桿菌，每株指示菌3個重復，正置28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況，并測量抑菌圈直徑。

1.6 統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0 軟件對不同芽孢桿菌的抑菌率進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，對同一芽孢桿菌24 h全菌液和24 h上清液的抑菌圈直徑進行student’st檢驗，對同一芽孢桿菌24 h全菌液和48 h全菌液的抑菌圈直徑進行student’st檢驗。P<0.05被認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定得到14株芽孢桿菌從養(yǎng)殖水體水樣中共分離得到14株芽孢桿菌，經(jīng)16S rDNA測序以及Blast比對分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，SCS-158、SCS-163、SCS-165和SCS-166為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；SCS-159和SCS-164為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）；SCS-160、SCS-162和SCS-170為 枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）；SCS-167為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；SCS-161、SCS-168、SCS-169和SCS-171為其他芽孢桿菌。

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2.214株芽孢桿菌24 h全菌液的抑菌效果從圖2可知，SCS-160和SCS-162對40株水產(chǎn)病原菌的抑菌率最高（20%），但SCS-171的抑菌率為0。從表3可知，SCS-160、SCS-162和SCS-170對指示菌中的全部維氏氣單胞菌（A. viridis）都有抑制效果，SCS-161可以抑制2株維氏氣單胞菌（A. viridis），其余芽孢桿菌則對所測試的維氏氣單胞菌（A. viridis）無抑菌效果；SCS-164對所測試的溶藻弧菌（V. alginolyticus）（A32，E36）均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為（10.67±0.58 ）和（11.33±2.08）mm，SCS-159、SCS-160和SCS-162有僅對溶藻弧菌（V. alginolyticus）E36有抑制作用，抑菌圈直徑分別為（9.67±1.53）、（8.67±1.15 ） 和（8.67±1.15）mm，其余沒有抑菌效果；SCS-160、SCS-161、SCS-162和SCS-170都表現(xiàn)出對葡萄球菌（Staphylococcusspp.）、異桿菌（Heterobacillispp.）和不動桿菌（Acinetobacterspp.）的抑制效果，而SCS-167、SCS-168和SCS-169僅 對 異 桿 菌（Heterobacillispp.）有抑制效果；14株芽孢桿菌中有10株對白葡萄球菌有抑制效果，其中，SCS-160和SCS-162的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到23.33 mm，其次為SCS-170，抑菌圈直徑為21 mm。

圖2 14株芽孢桿菌的抑菌率

2.3 芽孢桿菌24 h全菌液與24 h上清液的抑菌效果比較根據(jù)前面實驗，白葡萄菌的指示效果最好，14株芽孢桿菌中有10株對白葡萄菌有抑制效果，因此選用白葡萄球菌作為指示菌，進行后續(xù)實驗。如圖3所示，SCS-167、SCS-168、SCS-169、SCS-171芽孢桿菌全菌液和上清液都沒有抑菌效果；與全菌液相比，芽孢桿菌上清液的抑菌效果有所下降，抑菌圈有所縮??；SCS-160和SCS-162抑菌圈的縮小幅度最大，抑菌圈直徑分別減少27.13 %和28.55 %，SCS-159和SCS-164的縮小幅度最小，抑菌圈直徑分別減少7.44 %和5.35 %。全菌液和上清液中，SCS-160和SCS-162的抑菌效果最好。SCS-160、SCS-163和SCS-166芽孢桿菌24 h全液的抑菌效果和24 h上清液的抑菌效果差異顯著（P<0.05）。

圖3 芽孢桿菌全菌液與上清液對白葡萄球菌的抑菌效果對比

2.4 芽孢桿菌不同培養(yǎng)時間全菌液抑菌效果比較分析如圖4所示，SCS-167、SCS-168、SCS-169、SCS-171芽孢桿菌全菌液在培養(yǎng)24 h和48 h后對白葡萄球菌都沒有抑菌效果，SCS-160和SCS-162芽孢桿菌全菌液在培養(yǎng)24 h時，抑菌效果最好，抑菌圈直徑均為23.33 mm；培養(yǎng)48 h后，SCS- 160抑菌圈直徑較24 h時縮小42.86 %，而SCS-162抑菌效果最好，抑菌圈直徑為16.33 mm，較24 h時下降30.00 %；SCS-163芽孢桿菌的抑菌效果在24 h和48 h之間變化幅度最小，為4.19 %。SCS-158、SCS-160、SCS-161、SCS-162和SCS-170芽孢桿菌的24 h和48 h抑菌效果差異顯著（P<0.05）。

圖4 14株芽孢桿菌 24 h培養(yǎng)和48 h培養(yǎng)后的全菌液對白葡萄球抑菌效果對比

3 討 論

3.1 芽孢桿菌對水產(chǎn)病原菌的抑制作用芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種常見的微生物制劑，可以分解養(yǎng)殖過程中殘留的各種廢物，并抑制病原菌生長[32]。楊世平等[33]在研究產(chǎn)酸芽孢桿菌對對蝦養(yǎng)殖水環(huán)境影響時發(fā)現(xiàn)，投入芽孢桿菌可以使水體中弧菌的密度顯著降低。張皎皎等[34]從養(yǎng)殖池塘中篩選出對嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）有拮抗作用的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。張維娜[35]在異育銀鯽體外實驗中發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）對溫和氣單胞菌（A. solutes）和嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）有抑制作用。單金峰[15]在養(yǎng)殖水體中添加凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）使得青蝦體內(nèi)弧菌數(shù)量顯著下降。本研究從擬穴青蟹（S. paramamosai）養(yǎng)殖池溏水體中分離、鑒定了14株芽孢桿菌，并利用40株水產(chǎn)病原菌作為指示菌，對14株芽孢桿菌的抑菌效果進行初步研究，發(fā)現(xiàn)14株芽孢桿菌對水產(chǎn)病原的抑菌率最高為20.00%，其中，芽孢桿菌SCS-160、SCS-162、SCS-170對病原菌中的全部維氏氣單胞菌（A. viridis）有抑菌效果。由此可知，芽孢桿菌在水產(chǎn)病害防控中具有廣闊的應用前景。

3.2 不同發(fā)酵時間的芽孢桿菌的抑菌效果不同芽孢桿菌可以產(chǎn)生許多具有抑菌活性的物質(zhì)，例如脂肽抗生素、細菌素、拮抗蛋白、抗菌肽等[36?39]。但芽孢桿菌進入衰亡期，部分菌體自溶釋放的蛋白酶會降解部分抑菌物質(zhì)，或者發(fā)酵液中有害產(chǎn)物積累過多，導致細菌濃度降低，抑菌物質(zhì)活性降低，抑菌圈直徑下降[40]。這就解釋了為什么實驗中24 h的抑菌效果會好于48 h的抑菌效果。此外，芽孢桿菌在生長和繁殖過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌也具有一定的抑制作用[41]，這也在一定程度上解釋了芽孢桿菌24 h全菌液的抑菌效果要好于48 h。韓旭東等[42]的研究結(jié)果表明，芽孢桿菌ZYCHH-01在發(fā)酵時間為27 h時，細菌濃度和抑菌物質(zhì)活性最高，發(fā)酵時間27 h后，細菌濃度和抑菌物質(zhì)活性持續(xù)下降。這些都與本研究的結(jié)果相同。但范永瑞[43]在研究枯草芽孢桿菌抑菌作用時發(fā)現(xiàn)，抑菌效果先下降再上升，在24 h時最低。其主要原因可能在于抑菌物質(zhì)的不同所導致的，這需要進一步研究。

3.3 不同成分的芽孢桿菌培養(yǎng)液抑菌效果不同本研究發(fā)現(xiàn)，與24 h培養(yǎng)的菌液抑菌效果相比，芽孢桿菌的24 h培養(yǎng)的上清液的抑菌效果有所下降，但不同各芽孢桿菌的抑菌效果不同。芽孢桿菌SCS-160和SCS-162上清液抑菌效果下降最明顯，芽孢桿菌SCS-159下降幅度最小。陳成等[44]在研究枯草芽孢桿菌對桑椹采后致腐微生物的抑菌作用時發(fā)現(xiàn)，菌懸液的抑菌效果最好。這可能與其中有效成分有關，因此，可以對菌液中的有效成分進行進一步分析。