3種菌紋橡膠木的偏光熒光分析

閆 妍，秦 磊*，黃瓊濤，張玲梅，邱 堅(jiān)

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.宜華生活科技股份有限公司，廣東 汕頭 515800)

真菌在木材上生長(zhǎng)使木材著色形成花斑[1]。這個(gè)著色過(guò)程形成的圖案具有別具一格的自然特征，因此長(zhǎng)期被人們因“物以稀為貴”應(yīng)用于反映不平凡魅力的工藝場(chǎng)所。人工培植菌紋木也逐漸成為國(guó)內(nèi)一種獲得高檔新型木制裝飾材料的途徑?；ò吣居址Q(chēng)菌紋木，按著色效果可分為：菌紋線(xiàn)、染色、腐朽，其中菌紋線(xiàn)是最具價(jià)值的一種[2]。從15世紀(jì)開(kāi)始，西班牙等國(guó)家將菌紋木應(yīng)用于教堂的鑲嵌畫(huà)、工藝品和貼面單板上[3]。目前，我國(guó)對(duì)于菌紋木的應(yīng)用研究，還處于初始階段?，F(xiàn)有7種真菌能形成穩(wěn)定的花斑：多形炭角菌(Xylariapolymorpha)、白腐菌(Trametesversicolor)、煙管菌(Bjerkanderaadusta)、冬生多孔菌(Polyporusbrumalis)、絲孢菌(Arthrographiscuboidea)、小孢綠盤(pán)菌(Chlorociboriaaeruginascens)以及長(zhǎng)喙殼屬菌(Ceratocystisvirescens)[4]。將菌種兩兩組合接種有利于形成數(shù)量、類(lèi)型均更多的花斑，其中多形炭角菌可獨(dú)立形成花斑。一定菌種在一定樹(shù)種上形成的花斑是固定不變的[5]。

本研究選用未干燥處理的橡膠木(Heveabrasiliensis)薄板為試驗(yàn)對(duì)象，因其材色淺，著色效果顯著；木材收縮率低，具有穩(wěn)定薄板尺寸的效果；且新伐橡膠木的薄壁細(xì)胞組織中含有較高含量的碳水化合物，能夠滿(mǎn)足花斑真菌的生長(zhǎng)條件[6]。橡膠木作為一種極具廣闊前景和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的人工林樹(shù)種的地位已得到國(guó)際社會(huì)的承認(rèn)[7]，因此將橡膠木菌紋薄板運(yùn)用在家具行業(yè)上，不僅推動(dòng)了環(huán)保材料的更新，而且擴(kuò)寬了木質(zhì)產(chǎn)品的應(yīng)用，滿(mǎn)足了人們對(duì)“唯一性”的精神追求[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：選用的是從野外采集、分離的菌株和西南林業(yè)大學(xué)木材科學(xué)實(shí)驗(yàn)室何海珊[1]博士所保存下來(lái)的菌株。選用的木材是未干燥處理的橡膠木薄板。

其他材料:馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、過(guò)濾水。

化學(xué)試劑：75%酒精、95%酒精、0.1%升汞。

1.2 儀器設(shè)備

儀器設(shè)備具體見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)備

其他儀器：250 mL錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃棒、燒杯、培養(yǎng)瓶、解剖刀、鑷子、培養(yǎng)瓶。

1.3 木材含水率測(cè)定

根據(jù)培養(yǎng)瓶的大小把橡膠木切割成6.5 cm×15 cm×0.2 cm的薄板，用鼓風(fēng)干燥箱以(60±5)℃烘至絕干，待橡膠木薄板絕干后稱(chēng)其質(zhì)量(m0)。

將每瓶培養(yǎng)瓶種加入橡膠木薄板1片，加入不等量的無(wú)菌水，不等量無(wú)菌水每個(gè)梯度重復(fù)3，置于立式壓力蒸汽滅菌器里滅菌(121 ℃ 0.1MPa)30 min，取出，冷卻6～8 h后稱(chēng)量薄板的質(zhì)量(mt)。含水率公式如式(1)所示[1]。

K=[(mt-mo)]×100%

(1)

以加水量為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 mL來(lái)測(cè)量木材含水率，試驗(yàn)表明，菌株ZXH18-6在含水率為41.394%～46.003%時(shí)生長(zhǎng)較好，形成大量的菌紋線(xiàn)和花紋，在含水率為33.037%時(shí)，僅在表面形成黑色染色。菌株ZXH63-4在含水率為79%～99%形成的表面花斑量最多，在含水率為52%～99%形成的內(nèi)部花斑量最多；ZXH63-4形成的平均花斑量最多(圖1)。

圖1 木材含水率

1.4 固態(tài)菌株接種形成菌紋木的試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株擴(kuò)繁 從保存菌株的試管中挑起一些菌絲(或從野外采集來(lái)的菌紋木標(biāo)本中采集樣品)，在超凈工作臺(tái)上，把菌絲接種在PDA平板上，放置于恒溫恒濕箱中培養(yǎng)7～14 d。

1.4.2 橡膠木薄板滅菌 把橡膠木薄板放置于加有24 mL無(wú)菌水的培養(yǎng)瓶中，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌45 min，放置超凈工作臺(tái)上。

1.4.3 固態(tài)菌株接種 在接種前把培養(yǎng)瓶中的水分倒出，用解剖刀把PDA上的菌落切成約2 cm的小塊貼在薄板上，把接種好的薄板放在恒溫恒濕箱中培養(yǎng)56 d后取出來(lái)觀察是否產(chǎn)生菌紋線(xiàn)[9]。

1.5 偏光、熒光觀測(cè)

1.5.1 木樣處理 將菌株ZXH 18-6和ZXH 63-4制備成功的橡膠木菌紋薄板用聚乙二醇(PEG)包埋處理菌紋木薄板。PEG包埋將橡膠木薄板按2 cm×2 cm尺寸切割，放入無(wú)菌水中浸泡至飽水狀態(tài)。配制含量為30%、50%、70%、85%、100%的PEG溶液，將菌紋木薄板依次放入恒溫60 ℃的PEG溶液中浸泡24 h。處理好的菌紋木如圖2。

圖2 包埋后的菌紋木

1.5.2 切片制作 將無(wú)菌水點(diǎn)在樣品上，甘油涂抹刀片，游走切片機(jī)切16～20 μm的切片。把切片放入無(wú)菌水中清洗甘油，用軟毛毛刷按照橫切面、徑切面、弦切面的順序依次放在載玻片上，滴甘油蓋好蓋玻片，放置于恒溫加熱板上除去氣泡。其中菌株ZXH18-6培育的菌紋薄板選取了上端的花紋處和下端的黑色染色處2個(gè)部分做切片分析。

1.5.3 切片觀測(cè) 木材的纖維素分子有序排列形成的結(jié)晶區(qū)具有雙折射型，在偏光顯微鏡下會(huì)發(fā)亮，由此可以通過(guò)觀察圖像的明暗程度來(lái)判斷纖維素的降解程度[10]；木材中的木質(zhì)素因其含有的酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的強(qiáng)弱可以判斷木質(zhì)素的降解程度[12]。

將切片放于尼康數(shù)碼顯微鏡下用普通光、偏光、熒光觀察菌紋木的纖維素和木質(zhì)素的降解程度，并拍攝圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株特征分析

將從實(shí)驗(yàn)室保存的菌株ZXH7-2、ZXH28、ZXH62-2、ZXH18-6、ZXH63-4和野外采集的菌株2a、2b、2c在恒溫箱中培養(yǎng)8 d，經(jīng)分離、純化后觀察形態(tài)特征(表2)。

表2 8種菌株的形態(tài)特征

2.2 菌紋木宏觀分析

經(jīng)過(guò)56 d的固態(tài)菌株接種培養(yǎng)，ZXH18-6、ZXH63-4長(zhǎng)出了菌紋線(xiàn)。

鑒定結(jié)果：Diaporthesp.

分類(lèi)地位：半知菌亞門(mén)Deuteromycotina腔孢綱Coelomycetes球殼孢目Sphaeropsidales，有性階段屬于子囊菌亞門(mén)Ascomycotina核菌綱Pyrenomycetes炭角菌目Xylariales間座殼科Diaporthaceae間座殼屬Diaporthe[12-13]。

表3 所培育出的菌紋木宏觀分析

2.3 偏光和熒光顯微鏡分析

由表4可知，普通橡膠木薄板與菌紋橡膠薄板偏光和熒光發(fā)亮程度沒(méi)有明顯差異，且細(xì)胞壁未發(fā)生明顯的破損與凹陷分裂，黑色菌紋線(xiàn)兩側(cè)偏光及熒光的發(fā)亮程度沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明菌紋薄板花紋部分的橫切面木質(zhì)素和纖維素的降解程度都比較輕[14-15]。

表4 普通橡膠木與菌紋橡膠薄板橫切面普通光、偏光、熒光對(duì)比

由表5可知，菌株ZXH 18-6培育的菌紋木薄板徑切面交叉紋孔處的細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生斷裂，菌株ZXH 18-6、ZXH 63-4據(jù)熒光和偏光顯微鏡觀察，光亮強(qiáng)弱程度無(wú)明顯差異。

表5 普通橡膠木與菌紋橡膠薄板徑切面普通光、偏光、熒光對(duì)比

表6 普通橡膠木與菌紋橡膠薄板弦切面普通光、偏光、熒光對(duì)比

通過(guò)比較菌株ZXH18-6偏光圖像的花紋處與染色處，發(fā)現(xiàn)花紋處的纖維素降解程度輕(橡膠木薄板花紋處的含水率比染色處低一些)；在熒光顯微鏡下花紋處比染色處光亮強(qiáng),說(shuō)明染色處的木質(zhì)素的降解程度較嚴(yán)重，因此木材本身的含水率越高，越容易對(duì)木材造成腐朽[16]。

綜上所述，在熒光和偏光顯微鏡觀察下發(fā)現(xiàn)，菌株ZHX18-6、ZHX63-4培育的菌紋木和橡膠木正常材比較光亮程度沒(méi)有明顯差異，未見(jiàn)菌絲，沒(méi)有觀察到木質(zhì)素和纖維素明顯的降解現(xiàn)象[17-18]，即在56 d內(nèi)花斑真菌ZHX18-6、ZHX63-4對(duì)木材的腐朽情況影響不顯著。由此，在嚴(yán)格控制花斑真菌的菌種、生長(zhǎng)時(shí)間和木材含水率的情況下，將培育的菌紋薄板應(yīng)用在家具設(shè)計(jì)上是可能實(shí)現(xiàn)的。

3 結(jié)論與討論

本研究是從野外提取和西南林業(yè)大學(xué)何海珊博士所保存的菌株人工制備橡膠木菌紋薄板，并將制備成功的薄板進(jìn)行切片拍熒光和偏光圖像來(lái)分析其木質(zhì)素和纖維素的降解情況。

在培育菌紋木時(shí)沒(méi)有加入蛭石，僅使用單種菌株接種制備菌紋木薄板，其中ZHX18-6和ZHX63-4形成了菌紋線(xiàn)，說(shuō)明在沒(méi)有不良環(huán)境的阻礙或真菌種間的相互抵抗下也能形成菌紋線(xiàn)。

木材的含水率對(duì)花斑真菌的生長(zhǎng)尤其重要，本研究采用橡膠木薄板傾斜放于培養(yǎng)瓶中加水滅菌后造成木材上端含水率比較低，從而導(dǎo)致木材的含水率測(cè)量不精確。

在制備菌紋木試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株ZHX18-6在含水率為41.394%～46.003%生長(zhǎng)較好，可以形成大量的菌紋線(xiàn)和花紋，在含水率為33.037%只在表面形成黑色染色。

用熒光和偏光顯微鏡觀察木質(zhì)素和纖維素的降解程度沒(méi)有出現(xiàn)顯著現(xiàn)象，菌株ZHX18-6形成的菌紋木下端的木質(zhì)素和纖維素降解程度比上端較嚴(yán)重一些，表明含水率越高的地方，木質(zhì)素和纖維素降解得越快，同時(shí)也越容易造成木材腐朽現(xiàn)象。