基于葉綠體基因的文冠果遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)

劉 莉，趙永軍，王 磊，吳 丹，魯儀增，陸 璐，王 震，莊振杰，解孝滿,*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省林草種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250102)

文冠果(Xanthocerassorbifolium)又名文官樹(shù)、崖木瓜、文光果等，為無(wú)患子科(Sapindaceae)文冠果屬(Xanthoceras)落葉灌木或小喬木，單屬單種[1-2]。其不僅適應(yīng)性強(qiáng)，觀賞性好，而且葉、果、樹(shù)皮具有多種用途；種仁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，籽油主要脂肪酸為亞油酸和油酸，且富含植物源神經(jīng)酸，食用歷史悠久，是我國(guó)北方具有發(fā)展?jié)摿Φ奶赜心颈居土蠘?shù)種[3-4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記早已運(yùn)用到林木遺傳育種研究中[5]。文冠果核基因組于2019年發(fā)布共享，2021年初步實(shí)現(xiàn)了基于文冠果基因組的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證，有效促進(jìn)了文冠果的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)研究[6-8]。但是，目前文冠果基于核基因組的研究總體起步較晚，技術(shù)尚不十分成熟，參試的樣本較少，不足以全面揭示文冠果種質(zhì)資源遺傳多樣性特征。另外，由于文冠果交叉引種歷史較長(zhǎng)，基于核基因組解析當(dāng)前栽培群體和野生群體共存格局下的文冠果遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)及其遷移路線存在較大的技術(shù)瓶頸。

在大多數(shù)被子植物中，母系遺傳的葉綠體基因組具有高度保守、非編碼區(qū)進(jìn)化速度快等特點(diǎn)[9]，而且葉綠體基因組非編碼區(qū)中的基因間區(qū)具有豐富的遺傳變異[10]，葉綠體基因單倍型可直接用于植物遺傳多樣性檢測(cè)[11]，在系統(tǒng)發(fā)育研究方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12-13]。朱仁斌等[14]利用5條葉綠體基因片段對(duì)7個(gè)省份的38個(gè)文冠果野生群體(399個(gè)個(gè)體)進(jìn)行了地理譜系調(diào)查，研究表明文冠果具有較高的遺傳差異(Fst=0.765)和相對(duì)較低的基因流(Nm=0.03)。但該研究的參試樣本來(lái)自“東南—西北”方向的采樣帶，缺失內(nèi)蒙古、黑龍江、北京和山東等區(qū)域樣本，而且采用的引物數(shù)量較少，挖掘的單倍型較少，得出的進(jìn)化趨勢(shì)及相關(guān)結(jié)論仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

為進(jìn)一步深入了解當(dāng)前文冠果栽培群體和野生群體共存格局下的遺傳多樣性及其引種遷移格局變化，本研究基于葉綠體全基因組單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其單倍型特征進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，以期為文冠果種質(zhì)資源的有效保護(hù)與高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

以生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、結(jié)果量大為指標(biāo)，于2020-2021年從文冠果主要集中分布的16個(gè)地區(qū)(35°43′48″-44°34′48″N，107°39′01″-129°34′48″E)的栽培群體和野生群體進(jìn)行選優(yōu)，共計(jì)篩選優(yōu)樹(shù)172株，其中野生優(yōu)樹(shù)81株，栽培優(yōu)樹(shù)91株。調(diào)查優(yōu)樹(shù)生境信息，然后采集葉片，并快速置于硅膠顆粒中干燥備用。為確保文冠果樣品具有高度代表性，保持各采集單株距離至少200 m，以確保樣本之間無(wú)親緣關(guān)系；群體內(nèi)的樣本數(shù)量應(yīng)15份以上，數(shù)量不夠的群體以實(shí)際采集份數(shù)為準(zhǔn)，各群體材料來(lái)源情況見(jiàn)圖1。

圖1 不同文冠果群體采樣基本信息

1.2 樣本DNA提取及葉綠體基因組測(cè)序組裝

采用磁珠法提取文冠果葉片DNA，Nanodrop 2 000分光光度計(jì)(IMPLEN,CA,USA)、Qubit 3.0 Flurometer(life technologies,CA,USA)和1%濃度(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠分別進(jìn)行純度、濃度和完整性檢測(cè)。合格樣品由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司使用Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，讀長(zhǎng)為PE150，測(cè)序深度10×。Bcl-convert軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，使用BWA軟件的mem算法從每個(gè)樣品的全基因質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)(clean data)中提取出比對(duì)文冠果葉綠體參考基因組NC_037448.1的數(shù)據(jù)[13-14]；使用Get Organelle程序包進(jìn)行葉綠體基因組的組裝[15]；使用PGA軟件進(jìn)行注釋[16]。

變異分析軟件GATK檢測(cè)葉綠體基因組中所有的潛在的SNP位點(diǎn)[17]，使用Variscan軟件計(jì)算文冠果各群體的Nei多樣性指數(shù)(Nei)、香濃指數(shù)(H)、多態(tài)性信息含量(PIC)、核苷酸多樣性(Pi)以及群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)，Tajima's D值。其中：根據(jù)多態(tài)性信息含量的衡量標(biāo)準(zhǔn)：PIC≥0.5 時(shí)為高度多態(tài)性；0.25≤PIC<0.5 時(shí)為中度多態(tài)性；PIC<0.25 時(shí)為低度多態(tài)性[18]；種群分化程度用Fst來(lái)衡量，其取值從0到1，0表示2個(gè)種群間是隨機(jī)交配的，基因型完全相似，1則表示2個(gè)種群完全隔離[19]。

表1 SNP突變模式分布統(tǒng)計(jì)

172個(gè)樣本共有基因序列排序連接后，使用MAFFT(v7.205)比對(duì)后得到一致性比對(duì)文件[20]；使用DnaSP(v5.10)軟件計(jì)算單倍型參數(shù)、PopART(v1.7)軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(TCS network)、Admixture軟件構(gòu)建遺傳結(jié)構(gòu)(structure)圖、GVTA軟件構(gòu)建親緣關(guān)系(Kinship)圖[21-22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果葉綠體基因組特征及其差異分析

2.1.1 基因組特征分析 由圖2可以看出，172個(gè)文冠果優(yōu)樹(shù)樣本的葉綠體基因組均為共價(jià)閉環(huán)的雙鏈環(huán)狀分子，典型的4部分結(jié)構(gòu)，包含有大單拷貝區(qū)(LSC，large single-copy)、小單拷貝區(qū)(SSC，small single-copy)和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)(IRA和IRB，inverted repeats)。其序列全長(zhǎng)位于159 048～160 069 bp，均小于參考葉綠體基因組(161 231 bp)；LSC 區(qū)段長(zhǎng)度為86 190～86 946 bp，均大于參考葉綠體基因組的LSC長(zhǎng)度(85 299 bp)；SSC區(qū)段長(zhǎng)度為18 097～18 988 bp，參考葉綠體基因組的SSC長(zhǎng)度位于樣本SSC區(qū)段長(zhǎng)度之間；IRs區(qū)段長(zhǎng)度為27 243～27 257 bp，均小于葉綠體參考基因組的IRs區(qū)段長(zhǎng)度(28 620 bp)；且其GC含量均為37.7%，與參考葉綠體基因組的GC含量一致[23]。

圖2 以QS101為例文冠果葉綠體基因組環(huán)狀圖

注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)172個(gè)文冠果優(yōu)樹(shù)資源的葉綠體基因組中的基因種類和數(shù)量沒(méi)有明顯差異，其中1個(gè)蛋白編碼基因(rps12)含有3個(gè)拷貝；21個(gè)基因含有2 個(gè)拷貝，包括 10個(gè)蛋白編碼基因(ndhB、rpl2、rp123、rps7、trnA、trnA-TGC、trnI-GAT、trnI-CAU、ycf15、ycf2)、6個(gè)tRNA基因(trnI-GAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnA-UGC、trnR-ACG和trnN-GUU)和4個(gè)rRNA基因(16SrRNA、23SrRNA、4.5SrRNA和5SrRNA)。

2.1.2 葉綠體基因組SNP差異分析 與參考葉綠體基因組相比，共計(jì)從172個(gè)參試葉綠體基因組中檢測(cè)出6類突變，共有52 460個(gè)SNP位點(diǎn)。其中，C-T(G-A)突變類型數(shù)量最多,其次為T(mén)-C(A-G)變異數(shù)量為12 212個(gè)，C-G(G-C)突變類型最少為170個(gè)。由圖3可以看出，非編碼區(qū)的突變位點(diǎn)較多，其中atpI、petL、petN、rpoC2、petA、psbE、psbM、psbJ、trnE-UUC和trnT-GGU突變位點(diǎn)相較于其他基因多(Pi>2%)。編碼區(qū)ycf1基因的突變相較于其他基因也較高?？傮w來(lái)看，非編碼區(qū)具有高突變性，文冠果高突變位點(diǎn)主要在控制花器官發(fā)育和光合作用等有關(guān)基因上，為探究文冠果多樣性提供具體研究?jī)r(jià)值。

圖3 SNP位點(diǎn)的(Pi%)的百分比

2.2 不同群體文冠果遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 遺傳多樣性 遺傳多樣性分析顯示(表2)，11個(gè)文冠果群體的葉綠體基因組SNP位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC)在0.12(RG8)～0.35(RG4)，平均為0.27，看出多態(tài)性處于中低度水平。香濃指數(shù)(H)為0.25(RG8)～0.69(QS1)，平均為0.50。Nei多樣性指數(shù)(Nei)在0.14(RG8)～0.48(RG4)，平均為0.3，均<0.5，說(shuō)明文冠果基因多樣性水平偏低。核苷酸多樣性指標(biāo)(Pi)平均值為4.00×10-3，其中最高的是QS7群體，為6.12×10-3，核苷酸多樣性指標(biāo)(Pi)總體呈現(xiàn)比較低的狀態(tài)，其中QS6群體和RG8群體的Pi值最低。給每項(xiàng)指標(biāo)賦值，每項(xiàng)排名相加總分按照多樣性綜合指標(biāo)從大到小排序，群體遺傳多樣性水平為QS9>QS5>QS10>RG4>QS7>QS1>RG3>QS2>RG1>RG6>RG2>QS4>RG5>QS8>QS6>RG8。大部分野生群體的遺傳多樣性水平較高，而人工引種種植群體的多樣性較低，存在引種單一問(wèn)題。

表2 供試119個(gè)文冠果優(yōu)樹(shù)多態(tài)性信息

對(duì)16個(gè)群體進(jìn)行Tajima's D計(jì)算，結(jié)果在-0.115～0.258，Tajima'sD值為負(fù)時(shí)，表明種群經(jīng)歷過(guò)快速擴(kuò)張，其中QS6、QS8、RG1和RG8群體的Tajima's D值為負(fù)值，說(shuō)明這3個(gè)群體經(jīng)歷了快速擴(kuò)張，QS9和QS10群體的Tajima's D值為0，符合中性進(jìn)化假說(shuō)。

2.2.2 遺傳分化分析 遺傳分化系數(shù)(Fst)分析顯示(表3)，文冠果不同野生群體間的遺傳分化系0.012～0.933，其中最小的是QS9群體和QS6群體，說(shuō)明這2個(gè)群體存在較大的基因交流，遺傳分化不明顯，QS1、QS2、QS4和QS5與QS7、QS8、QS9和QS10群體兩兩之間Fst值較大，說(shuō)明黃河為界東西部文冠果資源交流較少。在人工種植群體中，幾個(gè)種植群體與QS10和QS8群體的Fst值都>0.5，幾個(gè)種植群體與QS7和QS9群體的Fst值也在0.5左右，表示群體間存在著很大的遺傳分化。

2.2.3 群體結(jié)構(gòu)分析 設(shè)置假定祖先數(shù)K為1～8，并分別計(jì)算其CV error值，并制作百分比堆積圖，當(dāng)K等于n時(shí)CV error值最小，則認(rèn)為群體中包含n個(gè)亞群較為合理。由圖4A可知，當(dāng)K=4時(shí)為最優(yōu)結(jié)果，因此172份文冠果資源分為4個(gè)祖先成分最為接近于群體的真實(shí)情況；如圖4B所示，本次分析的4個(gè)祖先成分主色段分別為藍(lán)色、黃色、橘色以及紫色。第Ⅰ群組主色段為黃色，包括7個(gè)野生群體(QS2、QS4、QS6、QS7、QS8、QS9、QS10)，共50份資源；第Ⅱ群組主色段為藍(lán)色，包括2個(gè)野生群體(QS1和QS2)，7個(gè)種植群體(RG1、RG2、RG3、RG4、RG5、RG6和RG8)其葉綠體遺傳背景較純；第Ⅲ群組主色段為橘色，4個(gè)野生群體(QS1、QS2、QS4和QS5)，7個(gè)種植群體(RG1、RG2、RG3、RG4、RG5、RG6和RG8)；第Ⅳ組為紫色，為QS2群體的4份文冠果資源。圖4C、圖4D與Structure圖結(jié)果吻合。

注：文冠果不同群體數(shù)量CV error曲線(A)；K=4時(shí)，文冠果Structure圖(B)；文冠果KinShip圖(C)；文冠果主成分(PCA)分析圖(D)。

2.3 文冠果葉綠體DNA單倍型多態(tài)性及其譜系地理結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 單倍型變異、分布及其多態(tài)性特征 由表4可以看出172份文冠果資源共有65種單倍型。QS6群體有14種單倍型，單倍型數(shù)量最多，QS2和QS4有8種單倍型，QS8有7種單倍型，RG4、RG5、RG6群體都有5種單倍型。QS9群體單倍型數(shù)量只有1個(gè)，是含有單倍型最少的群體。16個(gè)群體中有8個(gè)群體含有Hap_18，其中群體內(nèi)有37份資源含有該單倍型；7個(gè)群體含有Hap_11單倍型，其中有24份資源含有該單倍型。RG8群體(鄂爾多斯)中含有6種單倍型，在種植群體中含有單倍型種類數(shù)量最多；RG3群體(承德市)含有3種單倍型，在種植群體中含有單倍型種類數(shù)量最少。由表4可以看出，Hap_11、Hap_18單倍型在各個(gè)群體中分布廣泛，這2個(gè)單倍型是文冠果親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的重要的單倍型。

表4 各群體所含單倍型類型分布

由表5可以看出，QS1、QS2、QS5、QS7、QS8和QS9群體單倍型多樣性(Hd)達(dá)到1，其次是QS6和QS4群體的單倍型多樣性(Hd)達(dá)到0.98；最低是QS10群體的0.6。可見(jiàn)，人工種植群體的多樣性都普遍低，人為影響較大。QS5群體的單倍型多樣性方差(Vh)與單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)均為最高，分別為0.009 26和0.096，QS6群體的單倍型多樣性方差(Vh)與單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)最低，分別為0.000 44和0.021。

表5 供試172個(gè)文冠果優(yōu)樹(shù)單倍型多樣性信息

2.3.2 單倍型系統(tǒng)發(fā)育及其遺傳結(jié)構(gòu) 根據(jù)組裝好的國(guó)內(nèi)172個(gè)文冠果葉綠體基因組進(jìn)行單倍型分型并繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。圖5為野生群體文冠果資源單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，每個(gè)彩色圓代表著一種單倍型，圓的大小表示該單倍型所含有的樣本總量，2個(gè)圓之間的連接代表2個(gè)單倍型彼此相關(guān)，而連線上的短線代表由一種單倍型變成另一種單倍型所需要經(jīng)過(guò)的堿基替換個(gè)數(shù)。另外，每個(gè)黒色的圓點(diǎn)表示推斷缺失樣品可能存在的單倍型。該結(jié)果與葉綠體基因組遺傳結(jié)構(gòu)分組相對(duì)應(yīng)。第1支是由Hap_55變異形成的分支，主要包括28個(gè)單倍型，Hap_55是野生群體QS9的單倍型，屬于寧夏固原群體，由此單倍型變異而形成的野生資源單倍型主要包括QS4、QS6、QS7和QS8群體。除Hap_55到Hap_30和Hap_39的變異較大些外，其他單倍型之間的突變位點(diǎn)小，差異較小，這部分單倍型地理位置主要是在黃河幾字形西南側(cè)，子午嶺、黃龍山南部。這部分區(qū)域地形有河流與山脈，例如，QS9和QS8群體之間的六盤(pán)山、涇河、渭河，可能山的運(yùn)動(dòng)促使QS9群體的Hap_55的資源向四周擴(kuò)散。對(duì)應(yīng)的第2部分是缺失型單倍型形成的分支，包括QS1群體的資源和QS2群體部分資源，這部分資源位于陜晉段黃河?xùn)|側(cè)、太行山南側(cè)區(qū)域；第3支是由Hap_11形成的分支，是由太行山西北側(cè)的QS1群體中的單倍型變異而來(lái)，形成QS4群體和QS5群體的單倍型，這3個(gè)群體都分布在太行山、呂梁山、黃龍山和子午嶺形成的山脈的北側(cè)，因此推測(cè)該單倍型的分布與山脈有關(guān)；第4支是由缺失型單倍型變異而形成的4個(gè)單倍型，分別為Hap_14、Hap_15、Hap_16和Hap_17，這幾個(gè)單倍型對(duì)應(yīng)的是QS2群體中的QS201、QS202、QS203和QS204，為山西臨汾大寧縣群體資源，這幾部分為該區(qū)域特有單倍型，推測(cè)該區(qū)域有文冠果避難所。

圖5 野生文冠果資源單倍型網(wǎng)絡(luò)

文冠果引種時(shí)間較短，因此人為種植的文冠果葉綠體基因組變化不大。將野生群體與人為引種群體，共同建立單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)，通過(guò)單倍型變化探究人為引種的資源從哪些地區(qū)引種。在Hap_11形成的第3分支上，RG1、RG3、RG4和RG5群體可以確定從QS1群體引種，有共同的單倍型Hap_11。RG8資源與QS5群體共同單倍型為Hap_27。Hap_29的資源有QS5、RG4、RG5和RG8群體，且RG8群體資源的單倍型由Hap_29變異而來(lái)，基本可以確定RG8群體的文冠果資源是由QS5引種而來(lái)。Hap_29的資源有RG4、RG5和RG6，而這幾份資源是由QS10群體的資源引種而來(lái)。

圖6 供試172個(gè)文冠果優(yōu)樹(shù)單倍型網(wǎng)絡(luò)

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性作為生物多樣性的重要基礎(chǔ)，是物種長(zhǎng)期生存、進(jìn)化和適應(yīng)的結(jié)果[24]。文冠果長(zhǎng)期處于野生狀態(tài)，交叉引種繁雜，采用母系遺傳的葉綠體基因組SNP變異位點(diǎn)及單倍型可以較好地解決文冠果種質(zhì)資源的遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)。保護(hù)物種，換個(gè)層面說(shuō)就是保護(hù)物種的進(jìn)化潛力或遺傳多樣性[25]。若物種內(nèi)的遺傳多樣性水平越大，則說(shuō)明對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性就越大，其進(jìn)化的潛力也就越大[26]。但是，保護(hù)物種應(yīng)該有對(duì)物種多樣性水平和種群遺傳結(jié)構(gòu)全面的了解的基礎(chǔ)，因此了解物種的遺傳變異的空間分布模式對(duì)于科學(xué)有效地保護(hù)物種起著非常重要的作用[27]。目前文冠果野生資源，由于人為砍伐，已經(jīng)逐漸減少，因此需要提高文冠果資源保護(hù)意識(shí)，以便充分發(fā)揮文冠果的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、美學(xué)價(jià)值?？傮w來(lái)說(shuō)，文冠果分布范圍窄，適生區(qū)內(nèi)地形變化小，致使文冠果遺傳變化較小。本研究發(fā)現(xiàn)，野生區(qū)域的文冠果優(yōu)樹(shù)資源遺傳多樣性較高，而栽培區(qū)域文冠果遺傳多樣性普遍較低，因此在當(dāng)前野生群體與栽培共同存在的格局下，優(yōu)先保護(hù)野生群體，重點(diǎn)保護(hù)部分優(yōu)株群體，可促進(jìn)文冠果種質(zhì)資源的有效保護(hù)與高效利用。

3.1 基于SNP的多態(tài)性分析與群體結(jié)構(gòu)

SNP標(biāo)記往往是二等位多態(tài)性的，從理論上看，每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4 種不同的變異形式，但實(shí)際上發(fā)生的只有2種，即轉(zhuǎn)換和顛換。由于這種形式只有2種等位堿基，可以直接估計(jì)等位基因頻率，因此 SNP具有二態(tài)型[28]。葉綠體基因組SNP多態(tài)性分析，都表現(xiàn)出了野生群體的多態(tài)性大于人為栽培群體。研究表明，寧夏固原、陜西咸陽(yáng)、寶雞、山西大同、忻州、朔州群體的文冠果遺傳多樣性處于較高水平，遼寧省朝陽(yáng)市和河北省承德市的種植群體文冠果遺傳多樣性水平較高，指導(dǎo)我們?cè)诒Ｗo(hù)搜集文冠果野生材料時(shí)，盡量加大這幾個(gè)地區(qū)的取樣量和優(yōu)先對(duì)這些地區(qū)進(jìn)行保護(hù)。文冠果雖然在內(nèi)蒙古地區(qū)栽培面積大，但發(fā)現(xiàn)該區(qū)域遺傳多樣性水平并沒(méi)有很高，因此，內(nèi)蒙古引種文冠果問(wèn)題上應(yīng)注意多區(qū)域大范圍引種，可以引種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的文冠果資源作親本，其后代就能獲得更大的遺傳變異，為文冠果育種選擇提供更多的材料。文冠果野生資源人為破壞嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)對(duì)野外優(yōu)樹(shù)進(jìn)行保護(hù)，以此保護(hù)文冠果的多樣性。多態(tài)性信息含量(PIC)、Nei多樣性指數(shù)(Nei)和核苷酸多樣性指標(biāo)(Pi)顯示文冠果群體內(nèi)為低度多態(tài)性水平，這比基于SSR標(biāo)記的結(jié)果偏低，主要原因?yàn)槿~綠體基因相較于核基因變異較小[29-31]。

根據(jù)葉綠體基因組結(jié)果將文冠果分為4個(gè)組，可以劃為西部、中部、東北部和東南部。根據(jù)地形位置進(jìn)行分析，影響分組的因素為太行山、呂梁山、黃龍山和子午嶺形成的山系，陜晉段黃河和呂梁山圍成的區(qū)域，及陜晉段黃河，各個(gè)區(qū)域的親緣關(guān)系與Fst結(jié)果相同。

3.2 單倍型多態(tài)性及其分布特征

文冠果是古老的樹(shù)種，在漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中逐步積累了豐富的遺傳變異，因此形成了多樣的單倍型。本研究中，對(duì)119個(gè)文冠果的全葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序，從整個(gè)基因組層面充分挖掘多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)果顯示其單倍型變異豐富，多樣性高達(dá)0.9，比文獻(xiàn)報(bào)道的葉綠體單倍型多樣性高(0.76)[32]。進(jìn)而說(shuō)明，采用葉綠體基因片段，雖然基于檢測(cè)到的單倍型能夠適度解析文冠果的譜系地理信息，但是標(biāo)記數(shù)量有限，獲得標(biāo)記位點(diǎn)較少，不能準(zhǔn)確地了解文冠果單倍型情況。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育及引種遷移趨勢(shì)

遺傳變異在空間分布上產(chǎn)生遺傳分化，造就了一個(gè)物種種群的遺傳結(jié)構(gòu)[33]。群體的遺傳結(jié)構(gòu)改變是由于隨機(jī)的遺傳漂變及基因流的隔離[34]。葉綠體基因比較穩(wěn)定，不易變化，因此可以看出各群體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。甘肅合水和鄂爾多斯群體間的分化系數(shù)大，說(shuō)明這2個(gè)群體間的遺傳分化程度最高，即其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。承德和臨汾群體遺傳分化系數(shù)低，說(shuō)明這2個(gè)群體親緣關(guān)系比較近。大多數(shù)葉綠體基因組是母系遺傳，文冠果通過(guò)種子傳播來(lái)促進(jìn)群體間的基因流動(dòng)。從單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，合水、榆林和臨汾是野生資源主要分布區(qū)，這3個(gè)群體單倍型差異較大，結(jié)合野外觀察，文冠果種子只能散落在母樹(shù)四周，果實(shí)靠嚙齒動(dòng)物搬運(yùn)進(jìn)行傳播，且3個(gè)群體被子午嶺、呂梁山及黃河阻礙了種子傳播，對(duì)群體間的基因交流產(chǎn)生了重要影響。但是由于野生資源樣本量少，很多未知單倍型尚未挖掘，因此今后將進(jìn)一步增加野生型資源進(jìn)系統(tǒng)發(fā)育研究，進(jìn)而探明文冠果引種馴化及其遷移歷史，為文冠果種質(zhì)資源的保護(hù)利用提供支持。

不論是從單倍型進(jìn)行聚類還是SNP聚類，都表明文冠果分為4個(gè)亞群。從文冠果65種單倍型Network網(wǎng)絡(luò)圖中可以得出，文冠果有2次大規(guī)模擴(kuò)散，分別為Hap_27、Hap_11和Hap_18。其中Hap_27是重要的單倍型，分布在陜西榆林和延安一帶。Hap_11和Hap_18的擴(kuò)張與人為因素有關(guān)。Hap_11和Hap_55位于網(wǎng)狀圖的中心位置為古老型單倍型，位于固原市的 Hap_55單倍型擴(kuò)散的原因可能是由于六盤(pán)山、涇河、渭河的影響；而位于山西大同的Hap_11單倍型擴(kuò)散原因不清楚，需要增加樣本量進(jìn)一步探討。

在對(duì)人工栽培的文冠果與野生型文冠果的單倍型分析時(shí)，明確了現(xiàn)在人工栽培的文冠果來(lái)源地區(qū)。根據(jù)各個(gè)群體Fst值、共有單倍型及單倍型變異趨勢(shì)，看出本研究中赤峰市翁牛特旗和巴林左旗、北京東城區(qū)、淄博臨淄區(qū)、牡丹江、遼寧省朝陽(yáng)市和河北承德的資源是從山西大同引種而來(lái)；內(nèi)蒙古鄂爾多斯的文冠果是由呂梁市中陽(yáng)縣和榆林靖邊縣引種而來(lái)。